QUADERNO DELLE METODICHE

a cura del Laboratorio di Ricerca - Dipartimento di Emergenza e Trapianti d'Organo - Università degli Studi di Bari

 

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SILVER STAINING del GEL SDS-POLIACRILAMMIDE

COLORAZIONE ARGENTICA

 

La colorazione deve essere effettuata in contenitori di vetro. La sostituzione delle soluzioni va eseguita per aspirazione . Evitare che il gel si accartocci e si asciughi nei vari passaggi.

• Immergere il gel nella Sol. di Fissaggio e incubare 4-12 ore a temperatura ambiente in lenta agitazione

• Eliminare la soluzione di sviluppo

• Immergere il gel in Etanolo 30% ed incubare per 30 minuti a temp. amb.

• Ripetere questo ultimo step

• Porre il gel in abbondante acqua Milli Q per 10 min in lenta agitazione e effettuare tre lavaggi

• Porre il gel in una soluzione 0,1% di Nitrato d'Argento ed incubare 30 min. a temp. amb. in lenta agitazione

• Effettuare un lavaggio in acqua Milli Q

• Eliminare l'acqua e aggiungere un pò di soluzione di sviluppo preparata fresca. La soluzione deve essere sostituita ogni qualvolta si osservano depositi neri. Lasciare in lenta agitazione fino a comparsa delle bande e stoppare la colorazione quando le bande saranno dell' intensità desiderata. Occorrono 200 ml di tale soluzione per ogni gel 8x5 cm.

• Eliminare la soluzione di sviluppo e fissare in acido acetico 1% per 2'.

• Lavare il gel in acqua.

• Conservare il gel in glicerolo 10% a 4°C prima di essiccarlo.

• Disporre il gel su un foglio di carta 3MM, coprirlo con pellicola trasparente ed essiccare per 2 ore ad 80°C.

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LISI CELLULARE PER WESTERN BLOTTING

 

Le seguenti operazioni vanno effettuate mantenendo le piastre Petri su ghiaccio.

• Rimuovere il medium.

• Effettuare 2 lavaggi in PBS 1X freddo (conservato a +4°C) o BUFFER A o HANKS'.

• Porre nella piastra il RIPA BUFFER (300 ml nella piastra di 10 cm, 100 ml nella piastra da 6 cm).

• Con l'aiuto di uno scraper, distribuire il buffer e accumulare il lisato verso il bordo della piastra.

• Recuperare il lisato con la pipetta in tubi eppendorf.

• Vortexare e far riposare in ghiaccio le eppendorf per 30 min.

• Centrifugare a 12.000 rpm a 4°C per 10 min.

• Recuperare il surnatante prendendo nota della quantità.

• Conservare i surnatanti a -80°C non più di 3-6 mesi evitando scongelamenti ripetuti.

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METODICA W.B. PHAST SYSTEM

 

• Accendere il Phast System ed attendere che il display indichi la temperatura raggiunta di 15° C

• Risospendere 2,5-5 mg di proteine (preventivamente quantizzate) in 2 ml di LOADING BUFFER consigliato da Pharmacia. Se necessario concentrare i campioni in modo tale che il volume finale da caricare risulti 4 ml

• Risospendere 3 ml di MARKER con 2 ml dello stesso LOADING BUFFER

• Porre Marker e Campione per 10 min. a bagno maria a 100°C

• Centrifugare per 10 min. a 13000 rpm

• Aprire una confezione di gel e sistemarlo sul piano di corsa preventivamente inumidito, avendo cura di non formare bolle

• Caricare il pettine ed inserirlo nell'alloggiamento

• Impostare il programma n° 4

• Terminata la corsa, con apposito l'apparato, staccare il gel dal supporto di plastica

• Equilibrare in TOWBIN (TRANSFERT BUFFER 20% METANOLO) la membrana in nitrocellulosa e 6 fogli di carta 3M, tutti tagliati a sagoma del gel

• Applicare l'apparato di trasferimento al Phast System e sistemare sull'anodo:

- 3 fogli di carta 3M

- Membrana

- Gel (capovolto con la faccia superiore a contatto con la membrana)

- 3 fogli di carta 3M

- Catodo

• Impostare il programma n° 5 per il trasferimento

• Porre la membrana in PONCEAU S per visualizzare le bande proteiche e quindi controllare l'avvenuto trasferimento

• Effettuare vari lavaggi in PBS-T fino a che la soluzione non risulti limpida e la membrana non risulti pulita

• Tagliare la lane contenente la corsa del Marker e con un pennarello puntare le bande di interesse

• Tagliare l'angolo in alto a dx della membrana

• Porre la membrana in PBS-T con 2%BSA o PBS-T con Milk al 5%

• L'incubazione può essere effettuata over night a temperatura ambiente su shaker oppure a 37°C per 2 ore su shaker

• Lavare la membrana in 30 ml di PBS-T a temperatura ambiente su shaker:

- 1x15 min

- 2x 5 min

• Incubare con Ab primario diluito in PBS-T 1:1000 (4 ml Æ 4 ml), per 4 ore a temperatura ambiente o 2 ore a 37°C su shaker

• Lavare la membrana in PBS-T a temperatura ambiente su shaker:

- 3x15 min

• Incubare con Ab secondario diluito in PBS-T 1:1500 (3.5 ml Æ 4 ml), per 2 ora a temperatura ambiente su saker

• Lavare la membrana in PBS-T a temperatura ambiente su shaker:

- 2x15 min

- 3x15 min

• Effettuare un ultimo lavaggio in PBS 1X 0,1% SDS

• Preparare il Mix (Sol. 1 + Sol. 2) di sviluppo (Kit ECL). Il volume finale é determinato dalla seguente formula:

0,125 X Superficie in cm2 della membrana

• In camera oscura, incubare la membrana con il MIX per 1 min preciso

• Asciugare per capillarità l'eccesso di liquido presente sulla membrana; avvolgere la membrana nella pellicola ed esporre.

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METODICA WESTERN BLOTTING MINI PROTEAN BIO RAD

 

Preparazione campioni

• Dispensare in eppendorf la quantità di lisato corrispondente ai mg di proteine da correre.

• Concentrare i campioni.

• Dispensare in una eppendorf il Marker.

• Aggiungere ai campioni e al Marker il LAEMLI + DTT 400 mM nella proporzione di 3:1.

• Bollire i campioni e il Marker per 10 min.

• Centrifugare e usare il surnatante per la corsa.

 

Preparazione della camera elettroforetica

• Assemblare la camera elettroforetica.

• Versare una piccola quantità di PLUG nella camera.

• Dopo la polimerizzazione del "tappo" versare il LOWER GEL fino a circa 4,5 cm dal bordo della lastra.

• Per velocizzare la polimerizzazione, versare sul gel una piccola quantità di ALCOOL ISOAMILICO saturato con acqua o anche solo acqua deionizzata che deve essere eliminata prima di inserire l'upper gel.

• Dopo la polimerizzazione del lower gel versare l'UPPER GEL fino a riempire la camera.

• Inserire il pettine e attendere la polimerizzazione prima di staccare il pettine.

• Riempire la camera con RESERVOIR BUFFER -1X SDS 1%- e inserire l'apparato che contiene il gel.

• Con l'aiuto di una siringa pulire i pozzetti.

 

Corsa elettroforetica

• Effettuare una "precorsa" a 50 volts per 30 min.

• Con una vetrografica segnare sul vetro la posizione dei pozzetti.

• Caricare i pozzetti con i campioni e effettuare la corsa a 50 volts per circa 3ore.

 

Trasferimento

• Nell'apparato di trasferimento partendo dall'anodo, porre con la seguente sequenza:

- Spugna

- Carta 3M tagliata a sagoma del gel e imbevuta di Transfert buffer

- Membrana tagliata a sagoma del gel ed equilibrata in Transfert buffer

- Gel

- Carta 3M tagliata a sagoma del gel e imbevuta di Transfert buffer

- Spugna

• Chiudere "a libro" l'apparato di trasferimento e inserirlo nella camera riempita con TRANSFERT BUFFER.

• Effettuare il trasferimento over night a 30 volts, oppure per 1 ora a 100volts, coprendo la camera con Siberini.

• Il giorno seguente smontare l'apparato di trasferimento e tagliare la parte di membrana che contiene la corsa del Marker.

• Con un pennarello puntare le bande di interesse.

• Tagliare la membrana nell'angolo in alto a sinistra.

 

Blocking

• Usare una soluzione di PBS 1X con 0.1% Tween20 (T-PBS) e 2% di ALBUMINA oppure una soluzione di T-PBS con 5% di MILK ECL Kit.

• Incubare over night a temperatura ambiente su shaker, oppure per 2 ore a 37°C.

• Lavare la membrana in T-PBS a temperatura ambiente su shaker:

• 1x15 min

• 2x 5 min

 

Incubazione con Ab I°

• Diluire l'Ab primario 1:1000 in T-PBS

• Incubare per 2 ore a temperatura ambiente

• Lavare la membrana in T-PBS a temperatura ambiente su shaker:

- 3x15 min

 

Incubazione con Ab II°

• Diluire l'Ab secondario 1:1500 in T-PBS

• Incubare per 1 ore a temperatura ambiente

• Lavare la membrana in T-PBS a temperatura ambiente su shaker:

- 3x15 min

- 3x 5 min

• Effettuare un ultimo lavaggio in PBS 1x 0,1%SDS.

 

Rilevamento del segnale

• miscelare un ugual volume di SOLUZIONE DI SVILUPPO 1 e SOLUZIONE DI SVILUPPO 2 (Amersham ECL detection reagents RPN 2105, batch 78). Il volume finale deve essere sufficiente a coprire la membrana (0.125ml/cm2).

• Incubare 1 minuto a temperatura ambiente.

• Eliminare l'eccesso del reagente ed avvolgere la membrana in pellicola trasparente, evitando la formazione bolle.

• Porre la membrana con la superficie superiore sulla quale si sono trasferite le proteine, a contatto con la lastra autoradiografica.

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ESTRAZIONE RNA DA BIOPSIA

 

I FASE

• In un tubo Falcon sterile da 50 ml, porre la biopsia renale con 500 ml di sol. denaturante.

• Omogenare mediante l'uso del Politron. Raffreddare l'omogenato ponendo il tubo in ghiaccio e poi centrifugare a 4000 rpm per qualche minuto.

• Ripetere l'operazione più volte. Lavare la sonda al termine di ogni operazione.

Lavaggio Sonda del Politron:

- in Etanolo assoluto

- in H2O2

- in H2O DEPc

- asciugare con garza sterile.

• Conservare a -80 oppure continuare.

• Ad ogni campione aggiungere (si prende in considerazione il caso in cui si siano usati 500 ml di soluzione denaturante):

-500 ml di Fenolo Saturato con H2O DEPc (1:1 in rapporto alla Sol Denaturante)

-100 ml di Sevag (1:10 in rapporto alla Sol Denaturante + Fenolo)

-50 ml di Na Acetato 2M pH 4 (1:20 in rapporto alla Sol Denaturante + Fenolo)

• Vortexare e tenere 15 minuti in ghiaccio (la sospensione diventa torbida).

• Centrifugare a 12.000 rpm per 20 minuti a +4°C.

• Recuperare la fase acquosa misurando il volume in eppendorf DEPc.

• Nel caso di RIESTRAZIONE dell'interface recuperare ancora circa 300ml e aggiungere Sevag in egual volume. Mescolare e centrifugare a 12.000 rpm per 10 minuti a 4°C. Recuperare la fase acquosa ed aggiungerla alla precedente.

• Aggiungere alla fase acquosa totale recuperata un ugual volume di Alcool Isopropilico freddo (-20°C). Lasciare precipitare a -20°C almeno per 1 ora oppure Over Night.

• Mescolare per inversione e lasciare precipitare a -20°C almeno per 1 ora oppure Over Night.

 

II FASE

• Centrifugare a 14.000 rpm per 20 minuti a 4°C. In base alla quantità di sospensione cellulare iniziale, é visibile il pellet di RNA.

• Ridissolvere il pellet in 350 ml di Sol. Denaturante e aggiungere lo stesso volume di Alcool Isopropilico. Agitare e lasciare a -20°C per almeno 1 ora oppure Over Night.

N.B. La II Fase può essere omessa, in questo caso la I^ centrifugazione ^ della III Fase deve essere protratta per 20 minuti a 14000 rpm a 4°C

 

III FASE

• Centrifugare a 14.000 rpm per 10 minuti a 4°C.

• Lavare il pellet con 700 ml di Etanolo 75% DEP Freddo. Centrifugare a 12.000 rpm per 5 minuti a 4°C.

• Eliminare delicatamente il surnatante facendo attenzione a non toccare il pellet. Aspirare le piccole gocce residue di Etanolo con capillari sterili.

• Risospendere il pellet in H2O DEP e lasciare solubilizzare a 4°C Over Night.

IV FASE Preparazione del campione prima della lettura

• Lettura spettrofotometrica di 2 ml del campione diluiti in 600 ml di H2O DEP.

• Valutare il rapporto della densità ottica 260/280 . Una buona preparazione dell'RNA é espressa da un rapporto di 1.8-2.0.

• Calcolo della concentrazione dell'RNA : OD 260 x F.D. x F. E. (= 40)/1000 = [RNA] mg/ml

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ESTRAZIONE RNA da cellule

 

I FASE

• Per ogni ml di Sol. denaturante aggiungere:

-1 ml Fenolo Saturato con H2O DEP pH 5

-100 ml di Na Acetato 2 M pH 4 (1/20 del volume totale fenolo + sol. denaturante)

-200 ml di Sevag (Cloroformio:Alcool Isoamilico 49:1) (1/10 del volume totale fenolo + sol. denaturante)

• Miscelare bene e vortexare per breve tempo (la sospensione diventa torbida).

• Lasciare 15 minuti in ghiaccio.

• Centrifugare a 12.000 rpm per 20 minuti a 4°C

• Recuperare la fase acquosa (= fase superiore) in una nuova eppendorf misurando l'esatto volume.

Nel caso di riestrazione : Recuperare l'interface, aggiungere Sevag in egual volume, centrifugare a 12.000 rpm per 5 minuti a 4°C. Recuperare la fase acquosa e aggiungerla alla precedente.

• Aggiungere alla fase acquosa recuperata un ugual volume di Alcool Isopropilico freddo (-20°C).

• Mescolare per inversione e lasciare precipitare a -20°C almeno per 1 ora oppure Over Night.

 

II FASE

• Centrifugare a 14.000 rpm per 20 minuti a 4°C. In base alla quantità di sospensione cellulare iniziale, é visibile il pellet di RNA.

• Ridissolvere il pellet in 350 ml di Sol. Denaturante e aggiungere lo stesso volume di Alcool Isopropilico. Agitare e lasciare a -20°C per almeno 1 ora oppure Over Night.

N.B. La II Fase può essere omessa, in questo caso la I^ centrifugazione della III Fase deve essere protratta per 20 minuti a 14000 rpm a 4°C

 

III FASE

• Centrifugare a 14.000 rpm per 10 minuti a 4°C.

• Lavare il pellet con 700 ml di Etanolo 75% DEP Freddo. Centrifugare a 12.000 rpm per 5 minuti a 4°C.

• Eliminare delicatamente il surnatante facendo attenzione a non toccare il pellet. Aspirare le piccole gocce residue di Etanolo con capillari sterili.

• Risospendere il pellet in H2O DEP e lasciare solubilizzare a 4°C Over Night

• Volumi di H2O DEP consigliati:

-Cellule mesangiali (3 piastre Petri) 100 ml

-Cellule mesangiali (1 piastre Petri) 50 ml

Il volume in generale viene stabilito dall'operatore in base alle dimensioni del pellet finale ottenuto

 

IV FASE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PRIMA DELLA LETTURA

• Lettura spettrofotometrica di una piccola aliquota del campione (in genere 2 ml), diluita in 600ml di H2O DEP .

• Valutare il rapporto della densità ottica 260/280 . Una buona preparazione dell'RNA é espressa da un rapporto di 1.8-2.0.

• Calcolo della concentrazione dell'RNA : OD 260 x F.D. x F. E. (= 40)/1000 = [RNA] mg/ml

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METODICA PER LA SEPARAZIONE DEI GRANULOCITI

 

• Prelievo eparinato di 10 cc di sangue.

• In una provetta (Falcon) da 15 ml, stratificare lentamente 3,5 cc di sangue su 3 cc di Ficoll-Hypaque Mono-Poli Resolving Medium (M-RPM).

• Centrifugare a 1600 per 30', nella provetta saranno visualizzate 4 frazioni :

1) Plasma

2) Linfomonociti

3) Neutrofili

4) Globuli rossi

Tra le 3 ultime frazioni é contenuta una regione contenente M-RPM.

• Eliminare delicatamente con pipetta Paster di vetro il plasma e i linfomonociti.

• Separare i neutrofili con pipetta Paster di vetro.

• Lavare i neutrofili 2 volte con PBS pH 7,6 centrifugando ogni volta per 5'-10' a 1800 rpm.

• Risospendere il pellet, per 5'' in 1 ml di H2O distillata per rompere i globuli rossi eventualmente presenti, bloccare la reazione di lisi con 1 ml di soluzione fisiologica (shock osmotico).

• Centrifugare le cellule per 5'-10' con PBS a 1800 rpm. Ripetere il passaggio 2 volte.

• Risospendere i neutrofili in 1 ml di RPMI.

• Contare i neutrofili al microscopio in 4 quadranti della camera di Bürker; N° totale neutrofili = (x1+x2+x3+x4/4) x 200 (fattore della camera) x 1000 (vol. fin.) La lettura viene effetuata ponendo 450ml di liquido di Türk + 50 ml di sospensione cellulare.

• Risospendere il pellet in RPMI + FCS 10% + GLUTAMMINA 1% in una quantità di volume tale che la concentrazione finale sia di 2.500.000 cells/ml.

• Citocentrifugare 100ml di sospensione a 800 rpm per 1'.

• Controllare al microscopio la distribuzione delle cells dello spot ed eventualmente aggiustare la concentrazione affinché le cellule siano disposte in un solo strato.

• Fissare i vetrini in Alcool 95% preraffreddato a -20° C per 5' a +4° C (i vetrini dopo fissazionee possono essere conservati a -20° C per 3-4 settimane.

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METODICA PER LA SEPARAZIONE DEI LINFOMONOCITI

 

1. Effettuare il prelievo in provette sterili per vacutainer eparinate.

2. Diluire il sangue 1:1 con RPMI (o Hanks) .

ES: 15 cc di sangue eparinato più 15 cc di terreno completo.

3. Calcolare il numero di provette sterili da 15 ml per un multiplo di 5 cc.

ES: 5 cc di sangue per ogni provetta da 15 ml

Sangue più terreno completo = 30 ml

30 : 5 = 6

Saranno quindi utilizzate 6 provette sterili da 15 ml.

4. Porre 4 cc di Lymphoprep nelle provette sterili da 15 ml su cui saranno stratificati 5 cc di sangue diluito con pipetta Pasteur di vetro sterile, facendo cadere molto lentamente le prime gocce di sangue diluito per evitare il mescolamento tra Lymphoprep e sangue.

5. Distribuire il sangue diluito, eventualmente rimasto.

6. Centrifugare a 1800 rpm per 25 minuti.

7. Eliminare il medium più siero fino all'anello con pipetta Pasteur di vetro

8. Con un'altra pipetta Pasteur di vetro raccogliere l'anello di linfomonociti ponendo la punta della pipetta al di sotto dell'anello.

N.B. : si può saltare il punto 7. e raccogliere direttamente con Pasteur l'anello di linfomonociti.

9. L'anello raccolto deve essere posto in un tubo falcon da 15 ml (circa 6 cc) e diluito con RPMI (o Hanks) fino a 12 ml.

10. Capovolgere delicatamente la provetta per risospendere le cellule.

11. Centrifugare (per eliminare il Lymphoprep residuo) a 1600 rpm per 10 minuti.

12. Eliminare il surnatante; il pellet sarà costituito da linfomonociti.

13. Per ciascuna provetta porre 1 o 2 ml di RPMI (o Hanks) e risospendere le cellule. Restringere quindi il numero delle provette ponendo sempre 6 cc di sospensione + 6 cc di terreno fino ad arrivare ad una sola provetta seguendo sempre lo stesso procedimento.

14. Ottenuta l'ultima provetta eliminare il surnatante ed aggiungere X ml di RPMI (o Hanks).

La quantità di terreno che si aggiunge é in relazione al tipo di conta che si intende effettuare e al numero di cells atteso.

• Aggiungere 5 ml di RPMI (Hanks). Preparare una camera di Neubauer con vetrino coprioggetto; prelevare 250 ml di Tripan blue e porli in una provettina; aggiungere 200 ml di PBS sterile (filtrato), 50 ml di sospensione cellulare, miscelare bene, porre 7,5 ml di questa soluzione in un campo della camera e 7,5 ml nell'altro.

Contare solo le cellule vive cioé quelle non colorate.

Fare una media dei valori ottenuti contando nei due campi (lo scarto deve essere minimo), dividere il valore medio ottenuto per 5, moltiplicare per 104 per il fattore di diluizione (10) e poi per 5 (ml in cui sono risospese le cells).

x1+x2/5=x3 *105=x4*5=N° cell/5ml

• La conta può essere ottenuta anche in camera di Bürker con vetrino coprioggetto. Si effettua una diluizione 1:10 con liquido di Türk

450 ml di liquido di Türk + 50 ml di sospensione cellulare.

Si leggono almeno 3 campi e di questi si calcola il valor medio che verrà moltiplicatox200x1000.

N° di cells x ml = valor medio x 200 x 1000

15. Terminata la conta, centrifugare a 2000 rpm per 10', per permettere che si depositino le cellule. Eliminare l'RPMI ed aggiungere alle cellule la giusta quantità di RPMI supplementato con 2% di siero AB+ (o 10% FCS-Fetal Calcium serum), 1% glutamina, 1% pool di antibiotici. La concentrazione delle cellule può essere variabile a seconda dell'esperimento.

16. Le cellule saranno messe in coltura in presenza dello stimolo. Si allestirà anche una provetta in assenza di stimolo.

17. Terminata l'incubazione le provette vengono centrifugate a 2000 rpm per 10'. Il surnatante é raccolto e conservato per successivi dosaggi mentre le cellule vengono incubate con isotiocianato di guanidina per l'estrazione dell'RNA o saranno risospese ad una concentrazione X per allestimento dei citocentrifugati. Per ogni spot si utilizzano 100 ml di sospensione cellulare in cui saranno presenti 250.000 cells. Il citocentrifugato si ottiene per centrifugazione a 800 rpm per 1'.

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ESTRAZIONE di DNA da GEL di AGAROSIOMEDIANTE GENE CLEAN

Range di estrazione probe 500-15000 bp

 

• Tagliare la parte del gel (TAE Gel 1% in agarosio - percentuale che varia in base al peso molecolare del DNA da separare).

• Tarare la bilancia con una eppendorf e pesare il frammento di gel in tale provetta (non usare tubi di vetro).

• In base al peso del gel, aggiungere 3 volumi di NaI (Se il peso é di 0.5 gr, si aggiungerà 1.5 ml di NaI ).

• Incubare a 50-60°C per minimo 8 minuti, fino a che l'agarosio non si sia sciolto completamente; per gel di grandi dimensioni incubare a 55°C per 15 minuti e mescolare ogni 5 minuti, controllando che non vi siano aggregati. (NaI aumenta l'entropia del sistema ed abbassa il punto di fusione dell'agar ).

• Agitare ed incubare ancora per 5 minuti.

• Quando l'agar si é completamente sciolto, aggiungere il GLASS MILK.

- Preparazione del Glass Milk : Aggiungere 200 ml di acqua sterile e vortexare molto bene (circa 1 minuto di miscelamento vigoroso) fino a quando tutti i componenti sono in sospensione. E' bene tenere il tubo in posizione orizzontale quando viene vortexato.

La quantità di Glass Milk da aggiungere, viene calcolata come segue:

-Aggiungere 5 ml di Glasss Milk a soluzioni contenenti 5 mgr o meno di DNA.

-Aggiungere 1 ml in più di Glass Milk per ogni 0.5 mgr di DNA al di sopra dei 5 mgr. La quantità di Glass Milk deve essere precisa, perché se è leggermente in eccesso si possono avere problemi di eluizione del DNA dalla polvere di vetro.

Es: In un plasmide del peso molecolare totale di 5 K con inserto di 1 k ( peso espresso in mg) il peso molecolare della sonda sarà di 2 mg ( 1/5 del peso dell'intero plasmide)Plasmide 10 mgr ; Sonda 2/3 del Plasmide;Plasmide 3 mgr ; Sonda 7 mgrAggiungere quindi 9 mg di Glass Milk.

• Dopo aver aggiunto il Glass Milk, sospendere bene e lasciare la eppendorf capovolta in ghiaccio per 15 minuti (formazione del legame DNA-vetro).

Se il volume di legame é superiore a 1.5 ml, incubare per 15 minuti e miscelare ogni 5 minuti.

• Centrifugare per alcuni secondi alla massima velocità a temperatura ambiente.

• Eliminare il surnatante con una pipetta o capovolgendo la provetta (il pellet solitamente non si sposta). E' bene conservare il sopranatante nel caso in cui non vi sia un buon recupero di DNA.

• Lavare il pellet con 500 ml di NEW (NaCl / Ethanol / Water) WASH freddo per 3 volte. Risospendere e centrifugare per 5 secondi ogni volta.

• Dopo il terzo lavaggio eliminare il surnatante, centrifugare ancora per qualche secondo ed eliminare completamente le tracce di NEW.

• Risospendere il pellet con 15 ml di H2Odd o TE.

• Incubare 2-3 minuti a 55°C.

• Centrifugare per circa 30 secondi.

• Recuperare il surnatante delicatamente e metterlo in un nuovo tubo eppendorf.

• Aggiungere al pellet 5 ml di H2Odd o TE per recuperare il 20% del DNA ancora legato al Glass Milk.

• Incubare 2-3 minuti a 55°C.

• Centrifugare per circa 30 secondi.

• Recuperare il surnatante delicatamente e aggiungerlo al precedente.

• Per la corsa nel mini gel si carica 1/10 e 1/20 del volume finale di H2Odd oTE nel quale é stata risospesa la sonda.

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GEL DI SEQUENZA

 

PREPARAZIONE DELLE LASTRE

• Lavare accuratamente le lastre con detersivo e pulire con etanolo 70%. La lastra su cui si predilige che resti attaccato il gel deve essere trattata 2 volte con REPEL SILANO, l'altra 3 volte. Il REPEL SILANO si applica con carta assorbente imbevuta della soluzione. Tale soluzione deve essere utilizzata sotto cappa aspirante perchè tossica.

• Assemblare la camera come descritto nel manuale di istruzioni SEQUI-GEN Bio-Rad.

 

PREPARAZIONE DEL GEL (21x50 cm/0.4 mm)

Tappo

• A 20 ml di soluzione di Poliacrilamide 6% 8M urea aggiungere 250 ml di Ammonio persolfato10% e 60 ml di Temed.

• Versare tale soluzione su carta 3MM nel vassoio predisposto e inserire le lastre assemblate. Il tappo si forma per capillarità.

• Attendere la polimerizzazione che si completa in circa 10 minuti.

Gel

• A 60 ml di soluzione di Poliacrilamide 6% 8M urea aggiungere 500 ml di Ammonio persolfato 10% e 40 ml di Temed.

• Riempire la camera con una siringa da 30 ml evitando la formazione di bolle. Inserire il pettine. Lasciare polimerizzare per almeno un'ora.

• Procedere con un lavaggio accurato dei pozzetti con TBE 1X dopo aver estratto il pettine.

• Riempire la camera con TBE 1X (circa 1 litro).

• Effettuare la precorsa fino a che l'indicatore di temperatura posizionato sulle lastre non segna 50°C (30' a 1500 Volts).

• Caricare i campioni. Per una migliore lettura della sequenza è consigliabile un doppio caricamento dello stesso set di reazioni da sottoporre a una corsa lunga ed una corsa breve. A tal fine riservare per ogni sequenza otto pozzetti .

• Caricare i primi 4 pozzetti con le reazioni nell'ordine G, A, T, C.

• La corsa elettroforetica deve essere effettuata a 1500 Volts e bloccata quando il fronte di corsa segnato dallo xilene è di 10 cm.

• Caricare i rimanenti 4 pozzetti con le medesime reazioni nell'ordine predetto.

• Far migrare lo xilene dei primi campioni caricati ancora per 18 cm.

• Smontare la camera. Il gel resta adeso ad un lastra.

• Procedere ad un lavaggio del gel di 20' con una soluzione di acido acetico 10% e metanolo 12%.

• Eliminare la soluzione e lavare con ddH2O per 5'.

• Disporre il gel su un foglio di carta 3MM ed essiccare per 30' a 60°C.

• Esporre a -80°C. Il tempo di esposizione dipende dall'isotopo radioattivo utilizzato nelle reazioni di sequenza (35S richiede 12 ore di esposizione; 32P richiede 2 ore di esposizione).

 

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

• A3ml della reazione di sequenza aggiungere un volume di sample buffer denaturante (vedi CDGE).

• Denaturare per 5-10' a 90°C.

• Trasferire le provettine in ghiaccio.

• Centrifugare brevemente i campioni e procedere al caricamento.

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IBRIDIZZAZIONE CON OLIGO

3'-oligolabelling and detection system RPN 2130 -RPN 2131

 

• La temperatura di ibridizzazione dipende dalla sequenza della sonda. Impostare il fornetto di ibridizzazione ad una temperatura di 5-10°C inferiore alla temperatura di melting (Tm) dell'oligo.

Tm= 4x (n°G+n°C) + 2x (n°A+n°T)

• Preibridizzare per 30' in un volume di buffer di ibridizzazione pari a 0.125ml/ cm2 di membrana.

• Aggiungere 5-10 ng di oligo ogni ml di buffer.

• Ibridizzare per 1-2 ore.

• Procedere con i lavaggi di stringenza.

 

LAVAGGI DI STRINGENZA

• Effettuare due lavaggi di 5' a temperatura ambiente in 250 ml di SSC5X-SDS0.1%.

• Effettuare due lavaggi di 20' ad una temperatura di 10°C inferiore alla temperatura di ibridizzazione, il primo in 250ml di SSC1X-SDS0.1%, il secondo in 250ml di SSC0.5X-SDS0.1% previamente riscaldate.

• Conservare la membrana a -20°C fino al momento dello sviluppo.

 

SVILUPPO

• Lavare la membrana in buffer 1 per 1'. Utilizzare un volume di soluzione pari a 2ml/cm2 di membrana.

• Incubare per 30' a rt in buffer 1 allo 0,5% di blocking agent (fornito dal kit). Utilizzare un volume di soluzione pari a 0.25 ml / cm2 di membrana.

• Lavare la membrana in buffer 1 per 1'. Utilizzare un volume di soluzione pari a 2ml/cm2 di membrana.

• Diluire l'anticorpo anti-fluoresceina HRP 1:1000 in buffer 2 contenente lo 0.5 % di BSA. Utilizzare un volume di soluzione pari a 0.25 ml ogni cm2 di membrana. Incubare per 30' a rt.

• Sottoporre la membrana a 4 lavaggi di 5' a temperatura ambiente in buffer 2. Utilizzare un volume di soluzione pari a 2ml/cm2 di membrana per ogni lavaggio.

• Miscelare un ugual volume di SOLUZIONE DI SVILUPPO 1 e 2 (fornite dal kit). Il volume finale del mix deve essere pari a 0.125ml /cm2 di membrana.

• Incubare la membrana 1' a rt con tale soluzione.

• Eliminare la soluzione, avvolgere la membrana in pellicola trasparente ed esporre su lastra autoradiografica sensibile alla luce blu.

• Sviluppare dopo 5'. L' esposizione può essere aumentata o ridotta in relazione all'intensità del segnale.

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MARCATURA RADIOATTIVA DI SONDE A DNA CON 32P

 

FASE DI MARCATURA

• Porre 30 ng di probe ottenuto con il Gene Clean, in una eppendorf e portare a 45ml con ddH2O.

• Denaturare a 100°C per 5 minuti e porre poi in ghiaccio.

• Centrifugare brevemente.

• Porre i 45 ml contenente il probe denaturato nella provettina REDI PRIME (Amersham Batch 67A RPN 1633) contenente il Mix liofilizzato.

Mix : Nonameri random

Nucleotidi liberi (A-T-G)

Frammento di Klenow

• Mescolare delicatamente senza usare puntali e centrifugare.

• Aggiungere 5 ml di dCTP 32P (pari a 50 mCi) senza pipettare, miscelare ed incubare a 37°C per 10 minuti in bagno termostatato.

 

PREPARAZIONE DELLE COLONNINE DI RESINA MICROSPIN ( Pharmacia S-300 Columns):

• Vortexare

• Svitare di 3/4 il tappo

• Spezzare la punta della colonnina

• Inserirla in una provettina eppendorf

• Centrifugare a 3000 rpm per 2 minuti per eliminare il TE che equilibra la resina. Dopo la centrifugazione la resina si dispone a becco di flauto .

 

PURIFICAZIONE DELLA SONDA:

• Porre la colonnina in una eppendorf pulita.

• Depositare sulla resina la soluzione contenente il probe marcato.

• Centrifugare a 3000 rpm per 1 minuto (la resina trattiene i nucleotidi liberi - marcati e non - e fa passare il DNA).

• Misurare con una pipetta la quantità di eluato.

• A tale quantità aggiungere TE fino a 200 ml.

• Il probe marcato si conserva a -20°C in caso di immediato utilizzo oppure a -80°C in caso di conservazione prolungata.

 

LETTURA AL b COUNTER:

• Mettere un quadratino di carta 3M in due tubi da lettura.

• Imbibire i suddetti quadrati con 2 ml di soluzione contenente il Probe.

• Leggere a secco.

• Per l'ibridizzazione verranno utilizzati:

- 1x106cpm/ml liquido di ibridizzazione.

- 0.5x106cpm/ml liquido di ibridizzazione se il segnale di espressione é alto (GA3PDH).

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COLORAZIONE CON PONCEAU S

 

• Immergere la membrana in acqua deionizzata per 5 min. prima di effettuare la colorazione se questa si è asciugata

• Incubare 5-10 min in soluzione di Ponceau 1X in lenta agitazione a temperatura ambiente

• Quando le bande sono visibili lavare la membrana in PBS-T a temperatura ambiente effettuando diversi cambi della soluzione fino a che questa non diventi limpida

• Procedere con il blocking previsto dalla metodica di Western blot

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COLORAZIONE del GEL di POLIACRILAMMIDE con COMASSIE BLUE

 

• Immergere il gel nel colorante per 4 ore a temperatura ambiente in lenta agitazione

• Rimuovere il colorante e conservarlo per future colorazioni

• Decolorare con la soluzione Metanolo/A. Acetico per 4-8 ore cambiando la soluzione 3-4 volte

• Si consideri che tanto più è spinta la decolorazione tanto più bassa é la quantità di proteina che può essere detectata.

• Per una decolorazione più rapida:

Decolorare in 30% Metanolo 10% acido acetico

Decolorare in soluzione normale a 45°C

• Dopo la decolorazione porre il gel in acqua qualche minuto e successivamente in Glicerolo 20% fino all'essiccazione del gel

 

COLORANTE COMASSIE 0,25%

- COMASSIE BRILLANT BLUE R250 0,25g

- METANOLO 50% 90 ml

- A. ACETICO GLACIALE 10 ml

 

DECOLORANTE

- METANOLO 50% 90 ml

- A. ACETICO GLACIALE 10 ml

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MICRODISSEZIONE

-ISOLAMENTO DI GLOMERULI IN ORTOVANADATO-

 

Prelievo del campione

Per effettuare l'isolamento dei glomeruli é necessario prelevare almeno due frustoli renali durante la biopsia. Di questi, il primo verrà utilizzato per la diagnostica istologica, il secondo per la microscopia elettronica e per la microdissezione glomerulare.

Al momento del prelievo del campione é indispensabile accertare immediatamente l'idoneità del frammento bioptico e, soprattutto, prevenire la degradazione delle proteine fosforilate in Tyr contenute nel glomerulo da parte delle tirosin fosfatasi.

Allo scopo, é necessario avere a disposizione, nella stanza della biopsia, un microscopio a luce diretta o uno stereomicroscopio, per poter analizzare in estemporanea il frustolo prelevato. Tale operazione deve essere molto rapida in quanto, una volta identificata la porzione di corticale renale destinata alla microdissezione, essa deve essere subito posta in una provetta eppendorf contenente RPMI /Na3VO4 2mM ( stock 200mM conservato a +4°C).

A questo punto il campione, posto in ghiaccio, può essere portato in laboratorio ed avviato alla microdissezione.

Isolamento dei glomeruli

• Trasferire la biopsia posta in RPMI /Na3VO4 2mM in una capsula petri di vetro sterile, posta nel piatto in plexiglass refrigerante (contenente ghiaccio) sotto lo stereomicroscopio.

• Utilizzare due micro-aghi (tecnica dello "scraping"), per separare strutture tubulari, l'arteriola afferente ed efferente e la capsula di Bowman dai glomeruli.

• Raccogliere i glomeruli, una volta isolati, con un puntale sterile (0.1-2 ml Gilson senza filtro), precedentemente lavato in una soluzione di BSA allo 0.1% (50 mg/ml = 25 ml BSA 1mg/ml Æ 500 ml H2O), e successivamente, trasferli in una nuova capsula petri, contenente RPMI /Na3VO4 2mM.

• Porre la capsula petri sul piatto nero dello stereomicroscopio e illuminare lateralmente con le fibre ottiche a sorgente fredda. In questa fase, i glomeruli vengono rapidamente lavati in RPMI /Na3VO4 2mM al fine di eliminare eventuali particelle ben visibili in campo oscuro.

• Guidare i glomeruli ormai isolati verso una zona pulita della capsula mediante l'uso dei micro-aghi; in questa fase di rotolamento del glomerulo (tecnica del rolling), é possibile apprezzare la qualità dei glomeruli isolati e selezionare quelli intatti.

• Raccogliere 5 glomeruli in una provettina sterile da 0.5 ml e centrifugare per 5 secondi a 13000 rpm.

• Eliminare il surnatante ed effettuare altri due lavaggi in RPMI-1640. La raccolta del surnatante in questi passaggi va fatta con una pipetta Gilson P20 con puntale 0.2/10 non coattato controllando attentamente al microscopio che nel puntale non ci siano glomeruli prelevati involontariamente;

• Lasciare i glomeruli nel minimo volume possibile di soluzione.

Stimolazione

• Stimolazione con PDGF BB: Porre nella provettina contenente i 5 glomeruli 20 ml di RPMI w/o FCS-INS/20 ng di PDGF BB umano ricombinante 1 mg/ml ( Es: 294 ml RPMI + 6 ml di PDGF BB).

• Controllo: In un'altra provettina con 5 glomeruli aggiungere 20 ml di RPMI w/o FCS-INS.

• Porre le provettine in incubatore a 37°C, 5% CO2 per 10 min e poi in ghiaccio.

• Centrifugare 3 minuti a + 4°C a 12000 rpm, eliminare il surnatante ed effettuare due lavaggi con 10 ml di HANKS'centrifugando sempre con le stesse condizioni.

• Eliminare il surnatante ed effettuare la lisi.

Lisi

• Dopo aver aspirato il surnatante, i glomeruli vengono lisati con 4 ml di RIPA Buffer al quale é stato aggiunto in giornata PMSF 200 mM (5 ml per ml di RIPA c.f. 1mM) e Leupeptina 1 mg/ml (8 ml per ml di RIPA c.f. 8 mg/ml)

• Porre a +4°C over night.

• Conservare a - 80°C.

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CONSTANT DENATURING GEL ELECTROFORESIS

CDGE 8% 7,7M UREA (16x16 cm)

 

PREPARAZIONE GEL

• A 30 ml della soluzione di poliacrilamide 8% 7.7M urea aggiungere 300 ml di Ammonio Persolfato 10% e 30 ml di Temed.

• Riempire la camera utilizzando una siringa da 30ml. La polimerizzazione è completa dopo circa un'ora.

• Lavare accuratamente i pozzetti con TBE 1X prima del caricamento dei campioni, servendosi di una siringa da 5 ml.

• Caricare 10-15 ml di amplificato a cui è stato aggiunto il loading buffer denaturante nel rapporto 2:1.

• Effettuare la corsa elettroforetica a 185 Volts, ad una temperatura di 56°C in TBE 1X utilizzando il D-GENE SYSTEM BIO-RAD. Il tempo di corsa é in funzione dei pesi molecolari degli amplificati (250/150 bp Æ 6 ore; 150/100 bp Æ 4 ore).

• Procedere alla colorazione argentica.

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RICOSTITUZIONE PRIMERS

 

Ricostituire i liofilizzati in modo da avere soluzioni madre 100mM.

(1) Se è nota la quantità in ng

• Calcolare il peso molecolare (MW) del primer come segue:

MW= [(n°Ax 312.2) + (n°Gx 328.2) + (n°Cx 288.2) + (n°Tx 303.2) - 61]

• La mM è calcolata come rapporto fra la quantità in mg del primer e il relativo MW.

(2) Se è nota la quantità in nmoli

• Ricordare che:

mM (mmoli/l)= nmoli/ml

(3) Se non è fornita nessuna indicazione procedere come segue:

• Sospendere il liofilizzato in 1 ml di H2O deionizzata sterile preferibilmente filtrata.

• Effettuare una lettura spettrofotometrica a 260 nm di un aliquota di 5ml della sospensione di primers

5 ml Þ 700 ml con ddH2O Fattore di diluizione (Fd)= 140

• Calcolare la mM secondo i punti A oppure B:

(A ) nmoli/ml= DO260nm x Fd x 90/lunghezza oligo (n° basi)

(B) EmM = [(n°Ax 15200) + (n°Gx 12010) + (n°Cx 7050) + (n°Tx 8400)] 10-6

EmM è l'assorbanza di una soluzione 1mM

EmM : 1 = [DO260nm x Fd] : [ mM ] Þ [mM ]= [DO260nm x Fd] / EmM

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DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS (DGGE)

DGGE PERPENDICOLARE (16x16 cm)

 

• Assemblare la camera come descritto nel manuale di istruzioni D GENE SYSTEM Bio-Rad.

• Utilizzare 20 ml di 0% denaturing solution e 20 ml 100% denaturing solution. Aggiungere in ognuna delle due soluzioni 200 ml di Ammonio persolfato 10% e 20 ml di Temed.

• Aggiungere ai 20 ml di 100% denaturing solution 400 ml di DYE SOLUTION per visualizzare la corretta formazione del gradiente.

• Procedere al riempimento della camera servendosi del sistema 475 Gradient Delivery Bio-Rad.

• La polimerizzazione é completa dopo circa un'ora.

• Togliere il Comb Gasket ed il pettine.

• Effettuare un lavaggio del pozzetto con TAE 1X, utilizzando una siringa.

• Riempire la camera del D GENE con TAE 1X (7 litri). Impostare il termostato a 56° C ed attendere che si raggiunga tale temperatura (1 ora).

• Caricare 50-100 ml di amplificato a cui è stato aggiunto il loading buffer DGGE nel rapporto 1: 1.

• Le condizioni di corsa sono in funzione del peso molecolare dell'amplificato. Un frammento di circa 800 bp é stato risolto con una corsa elettroforetica a 90 Volts per 12 ore, mentre per un frammento di 200 bp é stata ottimale una corsa a 200 Volts per 3 ore.

• Procedere alla colorazione argentica.

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DOT BLOT

 

PREPARAZIONI CAMPIONI

• Utilizzare 2-5 ml di amplificato.

• Aggiungere ad ogni campione 50 ml di EDTA 0,1M pH 8 e 80 ml di NaOH 1N.

• Portare il volume di ogni campione a 200 ml con ddH2O.

• Incubare 20' a rt.

PREPARAZIONI MEMBRANA

• Tagliare la membrana delle dimensioni 12x8 cm.

• Equilibrare la membrana 5' in ddH2O.

• Trasferire la membrana in SSC 6X e lasciare per almeno 20'.

ESECUZIONE DOT BLOT

• Assemblare l'apparato BIO-RAD. Nel montaggio disporre sulla piastra in gomma 2 fogli di carta 3MM delle stesse dimensioni della membrana bagnati in SSC 6X .

• Posizionare su questi la membrana. E completare il montaggio dell'apparato.

• Eseguire 2 lavaggi dei pozzetti utilizzando in ognuno di questi 200 ml di SSC 6X.

• Caricare i campioni.

• Effettuare 3 lavaggi dei pozzetti utilizzando in ognuno di questi 100 ml di SSC 20X.

• Smontare l'apparecchio.

• Lavare la membrana in 200 ml di SSC 6X.

• Fissare la membrana per esposizione ai raggi ultravioletti di 2' oppure in stufa sottovuoto ad 80°C per 2 ore.

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METODICHE ISTOLOGICHE

 

Fissazione in liquido di Dubosq (vol.tot. 22.5 ml)

Ac. Picrico in soluzione alcoolica 15 ml

Formaldeide 40% 6 ml

Acido Acetico glaciale 1,5 ml

 

Inclusione di pezzi bioptici

Alcool 50° 30'

Alcool 70° 30'

Alcool 95° 20'

Alcool 95° 20'

Alcool 100° 20'

Alcool 100° 20'

Xilene 1 12'

Xilene 2 12'

 

Paraplast 1 30'

Paraplast 2 1h e 30'

 

Sparaffinamento

Xilene 5'

Alcool 100° 3'

Alcool 95° 3'

Alcool 70° 3'

Alcool 50° 3'

Acqua distillata Sciaquare a lungo

 

Ematossilina-Eosina (Mayer)

1. Sparaffinare fino all'acqua

2. Emallume di Mayer 10'-15'

3. Acqua di fonte corrente 15'

4. Acqua distillata Sciaquare a lungo

5. Eosina 5'-10'

6. Acqua distillata Sciaquare con la spruzzetta

7. Alcool 95° 2'

8. Alcool 100° 3'

9. Xilene 5'

10. Montare in Permount

 

PAS

1. Sparaffinare fino all'acqua

2. Ac. Periodico 1% * 30'

3. Acqua di fonte corrente 10'

4. Acqua distillata Sciaquare bene

5. Reattivo di Schiff (BDH) 30'

6. Acqua di fonte corrente 10'

7. Acqua distillata Sciaquare bene

8. Ematossilina Gill o Mayer Secondo metodica con successiva differenziazione (non passare nell'eosina)

9. Acqua distillata (Sciaquare con la spruzzetta)

10. Alcool 95° 3'

11. Alcool 100° 3'

12. Xilene 5'

13. Montare in Permount

* 1,5 cc Ac. Periodico 50% +100 cc Acqua distillata

 

Tricromica di Masson

1. Sparaffinare fino all'acqua

2. Fissare nuovamente in Bouin 1-2h a 60° e/o tutta la notte a temperatura ambiente

3. Acqua di fonte corrente Finché tutte le sezioni sono bianche

4. Acqua distillata

5. Ematossilina ferrica di Weigert (nuclei) 10'-15' (su vetrino)

6. Acqua di fonte Sciaquare

7. Alcool Acido Differenziare in 2-3 passaggi (solo nuclei colorati)

8. Acqua di fonte corrente 10'

9. Acqua distillata Sciaquare

10. Ponceau fucsina 15' (citoplasma)

11. Ac. acetico1% Sciaquare

12. Ac. fosfomolibdico 4% Differeziazione 10'-15'

13. Ac. acetico 1% Sciaquare (il collageno deve essere colorato debolmente)

14. Verde luce 2% 5'

15. Ac. acetico 1% Sciaquare a fondo

16. Alcool 95° 2

17. Alcool 100° 2'

18. Xilene 10'

19. Montare in Permount

Preparazione soluzioni :

a) Ematossilina ferrica :

Stessa quantità di soluzione A e di soluzione B

b) Ponceau-Fucsina :

Ponceau-Fucsina 1 gr

Ac. acetico glaciale 1 ml

Acqua distillata 100 ml

c) Light green :

Light green 2 gr

Ac. acetico glaciale 2 ml

Acqua distillata 100ml

Sciogliere il light green a caldo, far raffreddare filtrare con carta bibula e infine aggiungere l'acido acetico.

 

 

PASM (Argento)

1. Sparaffinare fino all'acqua

2. Ac. periodico 1% 20'-30'

3. Acqua di fonte corrente 10'

4. Acqua distillata (Sciaquare parecchie volte)

5. Xexamine silver solution 1 1/2 a 60°

6. Acqua distillata (Sciaquare parecchie volte)

7. Cloruro di d'oro 0,2% Differenziare in 2-3 passaggi (grigio)

8. Acqua distillata (Sciaquare parecchie volte)

9. Sodio tiosolfato 2% Immergere 2-3 volte

10. Bouin (60°) 30'

11. Acqua di fonte corrente (Sciaquare per 10')

12. Ac. fosfotungstico 1% 1'-2'

13. Acqua di fonte corrente (Sciaquare 5')

14. Chromotrope 2R 15'

15. Acqua distillata (Sciaquare 2 volte)

16. Alcool 95° 2'

17. Alcool 100° 2'

18. Xilene 10'

19. Montare in Permount

 

Preparazione soluzioni:

a) Stock hexamine silver solution (conservare in frigo)

A2No3 5% 5 cc aggiungere goccia a goccia

Esamina 3% 100 cc

b) Working hexamine silver solution

Stock hexamine silver solution 105 cc

Sodium borace 12 % (5%)

c) Chromotrope 2 R

Chromotrope 2 R 2 gr sciolti in

Ac. cloridrico (0,37 in 100 ml di acqua distillata)

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IBRIDIZZAZIONE IN-SITU

 

LINEARIZZAZIONE DELLE SONDE

FASE I

Prelevare due aliquote da 20 mg del DNA plasmidico da linearizzare ed allestire per ciascuna la seguente reazione:

DNA plasmidico x ml

Enzima di Restrizione 50 U

Buffer 10x 5 ml

dH2O y ml

Il volume finale di reazione è 50 ml

Incubare a 37°C in bagno termostatato o.n.

 

FASE II

Aggiungere a ciascun campione 0.5 ml dello stesso Enzima di Restrizione utilizzato per la linearizzazione.

Incubare a 37°C in bagno termostatato 1 h.

Stop della reazione in ghiaccio.

 

FASE III ( Precipitazione del DNA linearizzato)

Aggiungere a ciascun campione:

Sodio acetato 3M pH 5.2 5 ml

Etanolo 100% 110 ml

Vortexare i campioni.

Precipitare a -80°C per 30 min.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 30 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur ed effettuare un lavaggio del pellet con 1 ml di Etanolo 70%.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 5 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur e rimuovere ogni traccia di etanolo tenendo i campioni in concentratore per qualche minuto.

Risospendere il pellet in 20 ml di H20 depc così da ottenere una concentrazione finale di 1mg/ml per ogni campione.

Conservare i campioni a -20°C.

 

FASE IV

Controllare l' avvenuta linearizzazione del DNA plasmidico mediante elettroforesi su gel d' agarosio all' 1% in TBE, caricando 0.5 mg (=0.5 ml) di ogni campione.

 

35S TRASCRIZIONE

FASE I

Liofilizzare in provette eppendorf x aliquote di 35S-UTP corrispondenti a 40 mCi ( nel caso si utilizzi 35S-UTP Dupont, liofilizzare 3.2 ml).

 

FASE II

Allestire in ciascuna delle provette eppendorf in cui è stato liofilizzato l'35S-UTP la seguente reazione:

DNA linearizzato 0.75 ml (= 0.75 mg)

Buffer di Trascrizione 10x 0.5 ml

DTT 100 mM 0.5 ml

RNAsin 0.25 ml

mix di rNTPs * 0.75 ml

dH20 depc 1.75 ml

RNA polimerasi 0.5 ml

Il volume di reazione è 5 ml

* Nel mix ogni nucleotide è contenuto in concentrazione 10 mM.

Allestire la reazione tenendo i componenti in ghiaccio ed aggiungere gli enzimi all' ultimo momento prelevandoli direttamente dal -20°C.

Non vortexare.

Incubare a 37°C in bagno termostatato 1 h.

 

FASE III

Aggiungere ad ogni campione 0.25 ml dell' RNA polimerasi corrispondente.

Incubare a 37°C in bagno termostatato 30 min.

 

FASE IV

Aggiungere ad ogni campione:

ytRNA (50 mg/ml) 2.5 ml

RNAsin 0.25 ml

DNAse-RNAse free 0.25 ml

Aggiungere gli enzimi all' ultimo momento prelevandoli direttamente dal -20°.

Incubare a 37°C in bagno termostatato 8 min.

 

FASE V

Aggiungere ad ogni campione:

Na Acetato 3M pH 6 5 ml

dH2O depc 37.5 ml

Mescolare bene con la pipetta.

• Prelevare da ogni campione 0.5 ml per la lettura al b counter (CONTEGGIO ATTIVITA' TOTALE)

 

FASE VI (Estrazione fenolica)

Aggiungere ad ogni campione:

Fenolo saturato con dH2O depc 25 ml

Sevag ( cloroformio-alcool isoamilico 24:1) 25 ml

Vortexare e centrifugare a 12000 rpm per 5 min.

Recuperare la fase superiore.

Misurare l'estratto.

 

FASE VII (Estrazione con etere)

Aggiungere ad ogni campione 700 ml di etere (per pipettare l'etere immergere il puntale 3 volte nel liquido).

Agitare e centrifugare a 12000 rpm per 1 min.

Eliminare la fase superiore facendo attenzione al menisco tra le due fasi.

Ripetere l'estrazione.

Eliminare le ultime tracce di etere tenendo i campioni a 65°C in bagno termostatato per 10 min circa.

Misurare l'estratto.

 

FASE VIII

Aggiungere:

Na Acetato 3M pH 6 1/10 vol dell'estratto

Etanolo assoluto freddo 2 vol dell'estratto

Vortexare i campioni.

Precipitare a -80°C per 30 min.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 30 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur ed effettuare un lavaggio del pellet con 700 ml di Etanolo 70% depc.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 5 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur e rimuovere ogni traccia di etanolo mediante capillari di vetro.

Risospendere i campioni in

DTT 10mM 2.5 ml

dH2O depc 22.5 ml

Mescolare bene con la pipetta.

• Prelevare da ogni campione 0.5 ml per la lettura al b counter (CONTEGGIO TRASCRIZIONE).

 

FASE IX (Digestione alcalina)

Aggiungere ad ogni campione 25 ml di Buffer alcalino

Composizione del Buffer alcalino ( in ml)

Volume totale

50

100

200

300

400

500

NaHCO3 1M

4

8

16

24

32

40

Na2CO3 1M

6

12

24

36

48

60

DTT 1M

0,5

1

2

3

4

5

H20 depc

39,5

79

158

237

316

395

Mescolare bene ed incubare a 60°C in bagno termostatato per un tempo t calcolabile mediante la seguente formula:

t= ( Lo - Lf ) / kLoLf

Lo= Lunghezza originale dell'inserto (espressa in kb)

Lf= Lunghezza finale dell'inserto (0.15 kb)

k= costante (0.11)

Aggiungere ad ogni campione 50 ml di Buffer di Stop.

Composizione del Buffer di Stop (in ml):

Volume totale

100

200

300

400

500

600

700

1000

Na Ac 3M

6,6

13,2

19,8

26,4

33

39,6

46,2

66

Acido acetico

1

2

3

4

5

6

7

10

DTT 1M

1

2

3

4

5

6

7

10

H2O depc

91,4

182,8

274,2

365,6

457

548,4

639,8

914

 

FASE X

Dopo lo stop della digestione alcalina mediante il "buffer di stop", aggiungere:

Na Acetato 3M pH 6 10 ml

Etanolo assoluto 220 ml

Vortexare i campioni.

Precipitare a -80°C per 30 min.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 30 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur ed effettuare un lavaggio del pellet con 700 ml di Etanolo 70% depc.

Centrifugare a 12000 rpm a 4°C per 5 min.

Eliminare il surnatante mediante una pipetta pasteur e rimuovere ogni traccia di etanolo mediante capillari di vetro.

Risospendere i campioni in:

DTT 100 mM 1.5 ml

depc H2O 6 ml

• Prelevare da ogni campione 0.5 ml per la lettura al b counter (CONTEGGIO DOPO DIGESTIONE ALCALINA)

Aggiungere ad ogni campione:

Formammide 7 ml

Conservare i probes marcati a -80°C per 3 settimane al massimo.

Aggiungere ad ogni campione preparato per la lettura al b counter 2 ml di liquido di scintillazione prima di effettuare la lettura.

 

PROTOCOLLO PER L' IBRIDIZZAZIONE IN SITU

Scongelare i vetrini conservati a -80°C e lasciarli asciugare all' aria.

Tenere i vetrini a + 80°C per 30-60 sec.

Posizionare i vetrini in vaschette verticali , a zig-zag.

Se le fettine di tessuto sono state fissate subito dopo il taglio, procedere con la preibridizzazione, altrimenti fissarle nel seguente modo:

• PFA 4% in PBS 1x 20 min.

• PBS 1x 3 min.

 

PREIBRIDIZZAZIONE

Effettuare i seguenti passaggi:

• HCl 0.2 N 20 min.

• H20 depc 5 min

• Pronase 0.125 mg/ml in PBS 1x 10 min.

• Glicina 0.1 M in PBS 1x 30 sec.

• PFA 4% in PBS 1x 20 min.

• PBS 1x 3 min.

• Anidride acetica 1: 400 in trietanolammina 0.1 M pH 8 10 min.

• PBS 1x 5 min.

• Etanolo 30% in H20 depc 2 min.

• Etanolo 70% in H20 depc 2 min.

• Etanolo 90% in H20 depc 2 min.

• Etanolo 100%.

Lasciare asciugare i vetrini all'aria, sistemarli in scatole oscure e procedere con l'ibridizzazione.

N.B. Se le fettine di tessuto sono posizionate in basso, nella preparazione delle soluzioni considerare circa 30 ml per ogni vaschetta.

 

IBRIDIZZAZIONE

Utilizzare 25 ml di miscela di ibridizzazione contenente 200.000 cpm di sonda marcata.

La miscela di ibridizzazione deve essere costituita dal tampone di ibridizzazione e dal "5x probe" in rapporto 4:1.

 

FASE I

Preparare il tampone di ibridizzazione:

Composizione del tampone di ibridizzazione (in ml)

Volume totale

400

600

1000

1200

1300

1500

Formammide

200

300

500

600

650

750

10x Salts

50

75

125

150

162,5

187,5

H2O depc

36

54

90

108

117

135

DTT 1M

4

6

10

12

13

15

ytRNA 50mg/ml

10

15

25

30

32,5

37,5

Destran Solfato 50%

100

150

250

300

325

375

Vortexare alla fine della preparazione. Mantenere il tampone a + 80°C fino al momento dell' uso.

 

FASE II (Preparazione del 5x probe)

Composizione del 5x probe (in ml)

Formamide 50%

DTT 10 mM

200.000 cpm di probe marcato (per ogni vetrino).

H20 depc fino a volume.

 

FASE III

Denaturare i 5x probes a 80°C per 30 sec e porli subito dopo in ghiaccio.

Aggiungere a ciascun 5x probe 4 parti del tampone di ibridizzazione.

Mescolare molto bene e centrifugare per pochi minuti.

 

FASE IV

Disporre i vetrini orizzontalmente sui coperchi di scatole Kartell da 50 e 100 posti.

Dispensare 25 ml di miscela di ibridizzazione su ogni vetrino in corrispondenza del tessuto. Posizionare delicatamente un quadratino di parafilm sulla miscela e lasciare distribuire la goccia su tutto il tessuto evitando la formazione di bolle.

Chiudere le scatole e porle in busta contenente garza imbevuta con acqua in modo da creare un ambiente umido. Sigillare a caldo le buste.

Ibridizzazione a 50°C in forno per tutta la notte.

 

ACCORGIMENTI TECNICI

Preparare una quantità di miscela di ibridizzazione per un numero di vetrini superiore rispetto a quello da ibridizzare.

Esempio:

N° di vetrini da ibridizzare: 10.

Approssimare a 15 vetrini.

Calcoli per la miscela di ibridizzazione:

25 ml (quantità di miscela per vetrino) x 15 (n° approssimato di vetrini) = 375 ml

Preparare la miscela di ibridizzazione rispettando le seguenti proporzioni:

MIX DI IBRIDIZZAZIONE

5X PROBE (1/5) TAMPONE DI IBRIDIZZAZIONE (4/5)

375 ml 75 ml 300 ml

 

LAVAGGI DOPO IBRIDIZZAZIONE

1. Trasferire i vetrini dalle scatole di ibridizzazione in vaschette orizzontali (a zig-zag) ed effettuare il primo lavaggio con Buffer 1 preriscaldato, a 52°C per 1 h in agitazione (bagno termostatato).

2. Trasferire i vetrini in vaschette orizzontali (spalla a spalla) ed effettuare il secondo lavaggio in Buffer 1 preriscaldato, a 52°C per 4 h in agitazione (in fornetto di ibridizzazione).

3. Effettuare un lavaggio con Buffer 2 a 37°C per 15 min (in fornetto di ibridizzazione).

4. Trasferire i vetrini in vaschette verticali ed effettuare un lavaggio con Buffer 2 addizionato con RNasi A ( 20 mg/ml c.f.) 30 min a 37°C in agitazione.

5. Trasferire i vetrini in vaschette verticali ed effettuare un lavaggio con Buffer 2 per 30 min a 37°C in agitazione.

6. Trasferire i vetrini in racks e porli in un beaker da 2 lt. Effettuare un lavaggio in 1500 ml di SSC 2x per 30 min a temp. amb. in agitazione.

7. Effettuare un ulteriore lavaggio in 1500 ml di SSC 0.1x per 30 min a temp. amb. in agitazione.

8. Deidratare i vetrini in etanolo 30%, 70%, 90%, 100% effettuando lavaggi di 2 min l'uno.

9. Lasciare asciugare i vetrini all' aria e conservarli in luogo asciutto.

Buffer 1

200 ml

400 ml

1000 ml

1500 ml

Formammide

100

200

500

750

10x salts

20

40

100

150

DTT

0.305 gr

0.610 gr

1.542 gr

2.313 gr

dH2O

80

160

400

600

Buffer 2

1000 ml

1500 ml

2300 ml

2500 ml

1M tris-HCl pH8

10

15

23

25

0.5 M EDTA

2

3

4.6

5

Na Cl

29.2 gr

43.8 gr

67.2 gr

73.8 gr

DIPPING (CAMERA OSCURA)

Gelatina Ilford: diluire 1:1 con dH20

Gelatina Amersham: utilizzare non diluita

Le fasi da eseguire in camera oscura devono essere condotte al buio. E' possibile, al massimo, utilizzare una lampada a luce rossa schermata.

• Accendere il bagnetto in camera oscura (settato a 40-43°C).

• Spegnere la luce e mettere la gelatina nel bagnetto per 45 min (Ilford) o 15 min (Amersham).

• Riempire la cuvetta con la gelatina fino a raggiungere un livello opportuno (in base al numero di vetrini da immergere nella gelatina ed alla posizione delle fettine su tessuto).

• Posizionare la cuvetta contenente la gelatina in un beaker pieno d'acqua riscaldata a 40-43°C in modo da mantenere costante la temperatura della gelatina.

• Immergere ogni vetrino 3 volte nella gelatina, mediante un movimento up and down, evitando la formazione di bollicine nell'emulsione fotografica.

• Disporre i vetrini negli appositi racks, lasciarli asciugare al riparo dalla luce per minimo 1 ora ( coperti da buste nere).

• Conservare i vetrini in scatole scure (scatole Kartell da 50-100 posti) dividendoli per gruppi di esposizione e inserire nella scatola una bustina in cui é posto gel di silice. Orientare il coperchio delle scatole per il riconoscimento dei gruppi.

• Coprire le scatole con carta stagnola e riporle a + 4°C per il tempo necessario per lo sviluppo dei grani autoradiografici (2-4 settimane).

 

SVILUPPO E COLORAZIONE

Utilizzare la soluzione di sviluppo Kodak D-19 e la soluzione di fissaggio Kodak Unifix.

In particolare, per lo sviluppo dei vetrini immersi in emulsione fotografica Amersham, utilizzare le due soluzioni non diluite.

Per lo sviluppo dei vetrini immersi in emulsione fotografica Ilford, diluire la soluzione di sviluppo 1: 2 e la soluzione di fissaggio 1: 4 con acqua millipore.

Effettuare lo sviluppo al buio in camera oscura.

Tempi di sviluppo e di fissaggio:

Gelatina Amersham sviluppo: 5 min

dH2O 30 sec

fissaggio: 10 min

Gelatina Ilford sviluppo: 2 min 30 sec

dH2O 30 sec

fissaggio: 3 min

Al termine dello sviluppo, tenere i vetrini sotto acqua corrente per 10 min e procedere con la colorazione.

Emallume di Mayer: 1 min.

Passaggio rapido in dH2O.

Eosina 0.1% 30 sec

Passaggio rapido in dH2O.

Acetone assoluto: 2 min.

Xilolo: 1 min.

Lasciare asciugare i vetrini all'aria e montarli con il mezzo di montaggio Permount.

Colorazione alternativa ( Firenze - C. Grappone)

Ematossilina di Harris 2 min

dH2O 2 min

Eosina/Floxina 10 sec

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METODICA DI IMMUNOFOSFATASI ALCALINA (APAAP)

 

N.B.: Utilizzare vetrini trattati con sostanze collanti (derivati silanici, polilisina altro)

Spessore sezione di tessuto 4mm.

 

FISSAZIONE DEL TESSUTO

Porre le sezioni di tessuto su vetrini siliconati, fare essiccare all'aria e successivamente fissare in acetone per 5 minuti.

Dopo evaporazione completa dell'acetone, porre i vetrini in vaschetta contenente TBS.

 

FISSAZIONE DELLE CELLULE

Ogni spot deve presentare una concentrazione di 200.000 cellule.

Fissare in acetone per 5 min.

 

procedura

I^ INCUBAZIONE (in camera umida)

Porre 70 ml di anticorpo primario (monoclonale o policlonale) specifico, sul tessuto o sullo spot di cellule. Diluire l'anticorpo in soluzione a. Incubare per 30 minuti.

Lavare per 2 volte con TBS per 5 minuti in vaschette verticali.

II^ INCUBAZIONE (in camera umida)

(* si effettua solo quando si fa uso di Ab policlonali)

Porre l'anticorpo secondario (Mouse-a-rabbit) diluito 1:10 in soluzione b ed incubare per 30 minuti.

Lavare per 2 volte in TBS per 5 min.

III^ INCUBAZIONE

Porre l'anticorpo terziario (Rabbit-a-mouse) diluito 1:20 in soluzione b ed incubare per 30 minuti.(Questo anticorpo, prodotto nel coniglio e diretto contro le immunoglobuline murine, serve da ponte tra l'anticorpo primario ed il complesso immune APAAP).

Lavare per 2 volte in TBS per 5 min.

IV^ INCUBAZIONE

Porre il complesso immune APAAP diluito 1:50 in soluzione a, per 30 minuti.

Lavare per 2 volte in TBS per 5 min.

 

sviluppo

Effettuare lo sviluppo della reazione immergendo i vetrini in soluzione c per mezz'ora.

Controcolorare in ematossilina per 1 minuto.

Dopo aver rimosso l'eccesso di colorante sotto acqua corrente, asciugare all'aria i vetrini.

 

MONTAGGIO CON CRYSTAL MOUNT

Porre 2/3 gocce di crystal mount sulle sezioni di tessuto o sui citocentrifugati.

Distendere le gocce avendo cura di eliminare tutte le eventuali bolle formatesi.

Essiccare in stufa a 60°C per circa 30 minuti.

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DOPPIA IMMUNOFOSFATASI ALCALINA - IBRIDIZZAZIONE IN SITU (APAAP -ISH)

 

N.B.: Utilizzare vetrini trattati con sostanze collanti (derivati silanici, polilisina altro)

Spessore sezione di tessuto 6 mm.

 

FISSAZIONE DEL TESSUTO

Porre le sezioni di tessuto su vetrini siliconati, fare esiccare all'aria e successivamente fissare in PFA 4% in PBS 1X DEPc per 20 minuti.

Lavare i vetrini per 2 volte con PBS 1X DEPc, ognuna per 5 minuti. Procedere con la metodica APAAP.

 

FISSAZIONE DELLE CELLULE

Ogni spot deve presentare una concentrazione di 200.000 cellule.

Procedere come per il tessuto.

 

procedura

Effettuare la metodica APAAP incubando gli anticorpi in Modified RPMI* ed eseguendo i lavaggi in TBS DEPc.

Dopo lo sviluppo in Soluzione C, omettere la controcolorazione in ematossilina - eosina, e procedere con la metodica di ibridizzazione in situ.

 

Modified RPMI*

Conc. fin.

V.F. 2 ml

V.F. 4 ml

V.F. 5 ml

V.F. 6 ml

V F. 8 ml

RPMI 1X

1880 ml

3760 ml

4700 ml

5640 ml

7520 ml

BSA 1%

20 mg

40 mg

50 mg

60 mg

80 mg

EPARINA 5000 U/ml

54 mg

108 mg

135 mg

163 mg

215 mg

tRNA LIEVITO 3 mg/ml

120 ml

240 ml

300 ml

360 ml

480 ml
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METODICA COATING VETRINI

 

Preparazione vetrini: coating con APTS

a) Immergere i vetrini in una soluzione solfocromica pura per 15 min. Essendo la soluzione tossica questa fase deve essere effettuata sotto cappa chimica aspirante.

b) Lavare i vetrini in una soluzione detergente (usare detergente RNase-free) e, successivamente, in acqua deionizzata per 3-4 volte.

c) Asciugare i vetrini all'aria.

d) Immergere i vetrini in vaschetta contenente metanolo freddo per 3 - 4 min.

e) Trasferire i vetrini in una soluzione di APTS (3-aminopropyltriethoxy-silane, SIGMA) costituita da 6 ml di APTS e 250 ml di metanolo, ed immergerli 4 volte per un totale di 30-40 secondi.

f) Lavare in acqua deionizzata

g) Asciugare in stufa a 60° C per 1 ora

 

N.B.: Nel caso in cui si disponga di vetrini pre-cleaned, seguire la procedura a partire dal punto d).

 

Preparazione vetrini: coating con Poli-L-Lisina

a) Lavare i vetrini pre-cleaned in H2O distillata sterile per 10 minuti

b) Eliminare l'eccesso di H2O distillata

c) Immergere i vetrini in una soluzione contenente Poli-L-Lisina (Sigma) diluita 1:10 per 5 minuti

d) Asciugare in stufa a 60°C per 1 ora

e) Conservare in luogo asciutto e al riparo dalla luce (max sei mesi)

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METODICA DI DETERMINAZIONE PROTEICA BRADFORD (BIO-RAD)

 

PREPARAZIONE DEL REATTIVO BIO-RAD

1. Diluire il colorante BIO RAD 1:5 con ddH2O. Il volume totale da preparare va calcolato come segue: il numero delle provette totali (campione + Standard) x 2 (2ml per ogni provetta), + una maggiorazione del 50%.

2. Filtrare il colorante diluito con carta bibula.

 

ESECUZIONE DEL DOSAGGIO

Preparazione della scala

• Preparare una soluzione di BSA 0,8 mg/ml, diluendo 100 volte la soluzione già pronta BSA 80 mg/ml conservata a -20°C.

• Numerare 6 provettine eppendorf (in doppio) da utilizzare per la diluizione intermedia della curva standard da effettuare secondo il seguente schema:

ml BSA 0,8 mg/ml

ml ddH2O

1.

0

400

2.

25

375

3.

50

350

4.

100

300

5.

150

250

6.

200

200

• Vortexare.

• Numerare le provette da 5 ml, sia per la curva standard che per i campioni in doppio.

• Dispensare 2 ml di colorante diluito preparato in precedenza.

 • Aggiungere 50 ml di ogni punto della diluizione intermedia ottenendo una curva di taratura di BSA a 6 punti:

0 - 2,5 - 5,0 - 10,0 - 15,0 - 20,0 mg BSA

 

Preparazione dei campioni

 • Ai 2 ml di reattivo BIO-RAD, aggiungere 50ml di campione se la sua concentrazione presumibile è tale da poter essere letta secondo la parte intermedia della curva standard.

Esempio: Per un campione con concentrazione presumibile di 1,5 mg/ml si dovranno aggiungere solo 5 ml. Infatti in 5 ml di campione saranno presenti 7,5mg di proteine. Per porsi nell stesse condizioni dello standard, portare i 5 ml di campione a 50 ml con ddH2O.

• Vortexare.

• Trasferire il contenuto di tutte le provette, in cuvette di plastica per la lettura spettrofotometrica.

• Eseguire la lettura allo spettrofotometro a 595 nm, non prima di 10 min e non più tardi di 45 min.

• Calcolare la curva standard (O.D. sulla y e quantità assoluta di BSA sulla x) e la relativa correlazione, utilizzando il programma CRICKET GRAPH. Effettuare il calcolo della funzione per ogni campione e ottenere così la quantità di proteine contenute nel volume utilizzato per il dosaggio.

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DETERMINAZIONE INULINA

 

Metodica con Difenilammina

• Il campione da sottoporre ad analisi é costituito da:

- Siero prelevato in tempi diversi durante l'infusione di INULINA: B1 B2 B3 B4

- Urine emesse prima dell'infusione: U1

- Urine emesse dopo l'infusione: U2

- Soluzione infusa: SI

 

Preparazione reagenti

- NaOH 0.75 N (3g NaOH in 100 ml di H2O milli Q)

- H2SO4 6,25 N (1.3 ml H2SO4 95% in 4 ml di H2O milli Q)

- ZnSO4 10% (10g ZnSO4 eptaidrato in 4 ml di H2SO4 6,25 N portati poi a 100 ml con H2O milli Q)

-NaOH 4 N (16 g NaOH in 100 ml di H2O milli Q)

• Sotto cappa chimica preparare la soluzione di DIFENILAMMINA (quantità idonea per la determinazione di 2 campioni + lo standard in doppio):

- 1 gr DIFENILAMMINA

- 42.8 ml Acido Acetico Glaciale

- Aspettare che la soluzione diventi limpida e poi aggiungere:

- 25.8 ml Acido Cloridrico 37%

• Diluire lo standard INULINA 10gr/dl a 0.1gr/dl (dil. 1:100):

La fiala di 20 ml di Inulina sovrasatura, va sciolta a bagno maria a 100°C, poi aperta sotto cappa sterile e portata a 200 ml con ddH2O sterile (dil. 1:10) = 1 gr/dl. Al momento dell'analisi 1 ml di tale soluzione verrà portato a 10 ml con ddH2O (dil. 1:10) =0.1 gr/dl (Soluzione di Lavoro) ed utilizzato per la preparazione della curva standard.

 

Deproteinizzazione del siero

• Porre in provettine di plastica da 5 ml non sterili:

- 1500 ml ddH2O

- 200 ml NaOH 0.75N

- 200 ml ZnSO4 10%

- 100 ml Siero (B1 B2 B3 B4)

• Vortexare e lasciare sedimentare a temperatura ambiente per 15 minuti.

• Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti. Il surnatante* verrà utilizzato per la determinazione dell'inulina.

 

Preparazione delle urine finali e della soluzione di infusione

- Urine Finali 1:100 (15 ml urine + 1485 ml ddH2O) ý

- Urine Finali 1:200 (750 ml I^ diluizione + 750 ml ddH2O) ý

- Soluzione di Infusione 1:200 (7.5 ml urine + 1496.5 ml ddH2O) Q

- Soluzione di Infusione 1:400 (750 ml I^ diluizione + 750 ml ddH2O) Q

 

Preparazione dello standard

• Preparare la curva standard in doppio come segue:

n° eppendorf STANDARD•(Inulina) ddH2O [ ]

1 750 ml di Sol. Lav. 750 ml 50 mg/dl

2 750 ml di 1 750 ml 25 mg/dl

3 750 ml di 2 750 ml 12.5mg/dl

4 750 ml di 3 750 ml 6.25mg/dl

5 100 ml di 1 900 ml 5 mg/dl

6 100 ml di 2 900 ml 2.5 mg/dl

7 100 ml di 3 900 ml 1.25mg/dl

8 100 ml di 4 900 ml 0.625mg/dl

9 - 900 ml 0 mg/dl

• Le eppendorf 1 e 2 verranno scartate

• Seguire il seguente schema in provettine di vetro da sierologia non sterili:

 Surnatante Siero* Urine U1 Urine diluiteý Soluzione di infusioneQ

Standard 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml

NaOH 4N 125 ml 125 ml 125 ml 125 ml 125 ml

• Porre a bagno maria a 100° C per 10 minuti e poi aggiungere:

 Sol. Difenilammina 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2ml

• Porre a bagno maria a 100° C per 30 minuti. Tale operazione deve essere effettuata sotto cappa aspirante.

• Lasciare le provettine sotto cappa a temperatura ambiente per 30 minuti.

• Effettuare una lettura spettrofotometretrica a doppio raggio a 620 nm (programma n° 4).

• Costruire la retta standard e interpolare per determinare la concentrazione dei campioni.

• Moltiplicare il valore ottenuto della concentrazione sierica per 20 (F. D. applicato durante la metodica).

• Moltiplicare il valore delle urine e della sol. di Infusione per il F.D. applicato (100 e 200 per le urine e 200 e 400 per la Sol Inf.)

• Applicare la formula [U]xV/[P] per calcolare la Clearance dell'inulina.

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TRASFORMAZIONE DI BATTERI COMPETENTI CON DNA PLASMIDICO

Tutte le operazioni finalizzate alla messa in coltura dei batteri vanno condotte sotto cappa sterile utilizzando materiale, terreni e soluzioni sterili.

I batteri utilizzati nel nostro laboratorio appartengono al ceppo JM105 della specie E. Coli, AmpS.

1. Far raffreddare un tubo sterile da 15 ml in ghiaccio.

2. Prelevare dallo stock in glicerolo 100 ml di batteri competenti, evitando di scongelare l'intera sospensione, e porli nel tubo freddo.

3. Aggiungere 2 ml di DNA plasmidico ( precedentemente diluito alla conc. di 100 ng/ml) facendo attenzione a non pipettare; rimescolare mediante un delicato movimento rotatorio della pipetta.

4. Incubare in ghiaccio per 45 min e di tanto in tanto risospendere manualmente i batteri.

5. Incubare la sospensione in bagno termostatato a 42° C per 45 sec.

6. Incubare immediatamente in ghiaccio per 2 min.

7. Aggiungere alla sospensione 900 ml di S.O.C. Medium* a temp.amb.

8. Incubare la sospensione in bagno termostato a 37° C in agitazione per 2h.

9. Conservare la sospensione a 4°C per non più di un mese.

*S.O.C. Medium (100 ml)

Preparare le seguenti soluzioni madri:

NaCl 1M (10 ml)

Sciogliere: NaCl 0.58 g in 10 ml di ddH20.

KCl 1M (10 ml)

Sciogliere: KCl 0.74 g in 10 ml di ddH20.

Mg+2 Stock 2M (10 ml)

Sciogliere: MgCl2 0.95 g (1M)

MgSO4 2.46 g (1M)

in 10 ml di ddH20.

Glucosio 2M (10 ml)

Sciogliere: glucosio 3.60 g in 10 ml di ddH20.

Sciogliere in 97 ml di ddH20:

Bactotriptone 2 g c.f. 2%

Yeast Extract 0.5 g c.f. 0.5%

NaCl 1 ml NaCl 1M c.f. 10 mM

KCl 0.25 ml KCl 1M c.f. 2.5 mM

Autoclavare.

Far raffreddare fino a temp.amb. ed aggiungere:

Glucosio 1 ml c.f. 20 mM

MgCl2, MgSO4 1 ml Mg+2 Stock 2M c.f. 20 mM

Filtrare con filtro da 0.22 mm e conservare a 4°C.

Non riutilizzare le soluzioni madri.

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STOCK DEI BATTERI IN GLICEROLO

 

Questa operazione deve essere condotta sotto cappa sterile utilizzando materiale, terreni e soluzioni sterili.

1. Prelevare 1 ml di sospensione batterica da una coltura pura ottenuta a partire da una colonia singola ( vedi " Minicoltura" ) e porla in un tubo Falcon da 15 ml.

2. Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile al 40% e mescolare pipettando delicatamente.

3. Dispensare aliquote da 500 ml in tubi per crioconservazione da 1.8 ml.

4. Conservare a -80°C e lasciare congelare.

E' comunque possibile conservare volumi più grandi di batteri, rispettando la concentrazione finale del 20% di glicerolo.

SOLUZIONI NECESSARIE PER LO STOCK IN GLICERLO

Glicerolo sterile al 40%

Metodica già descritta (vedi "Competenza " ).

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MINIPREP DI DNA PLASMIDICO

 

1. Prelevare sterilmente un'aliquota di sospensione batterica fino a riempire un tubo eppendorf.

2. Centrifugare 2 min a velocità massima (13000 rpm) in microcentrifuga.

3. Rimuovere il surnatante.

4. Ripetere la raccolta del pellet ( fasi 1; 2; 3;) nello stesso tubo.

5. Risospendere il pellet batterico in 100 ml di TE pH 8.

6. Aggiungere 200 ml di soluzione di lisi preparata al momento ( SDS 1% NaOH 0.2 N) e mescolare delicatamente mediante un movimento "up and down" della provetta.

7. Tenere la sospensione in ghiaccio per 5 min.

8. Aggiungere 150 ml di soluzione neutralizzante ( Potassio Acetato 3M Acido acetico 2M) e mescolare delicatamente (vedi fase 5).

9. Tenere in ghiaccio 5 min.

10.Aggiungere 250 ml di Fenolo saturato con Tris-HCl pH 8 e vortexare.

11.Centrifugare a 13000 rpm per 5 min.

12.Recuperare la fase acquosa evitando di prelevare gocce di fenolo.

13.Aggiungere alla fase acquosa recuperata Etanolo assoluto freddo fino a riempire la provetta ed agitare vigorosamente.

14.Tenere a -80 °C per minimo 1 ora.

15.Centrifugare a 13000 rpm per 10 min.

16.Eliminare il surnatante facendo attenzione a rimuovere ogni traccia di etanolo ponendo i campioni per pochi minuti in concentratore).

17.Risospendere il pellet in 50 ml di TE pH 8.

 

SOLUZIONI NECESSARIE PER LA MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO

 TE pH 8 (500 ml)

Tris-HCl pH 8 5 ml

EDTA pH 8 1 ml

ddH20 494 ml

Autoclavare e conservare a temp. amb.

 

Soluzione di lisi ( 2 ml :NaOH 0.2 N, SDS 1%)

Na OH 1N 400 ml

SDS 10% 200 ml

ddH20 1400 ml

Non conservare.

 

Soluzione neutralizzante (500 ml: K Acetato 3M Acido acetico 2M)

Sciogliere in 450 ml di ddH20:

Potassio Acetato 147 g

Acido acetico 57.5 g

Portare a volume.

Autoclavare e conservare a temp. amb.

 

 

Fenolo saturato con Tris-HCl pH 8 (20 ml)

Aggiungere a 20 ml di fenolo

Tris-HCl 0.5 M pH 8 20 ml

Idrossichinolina 20 mg c.f. 0.1%

Mescolare vigorosamente e lasciare a 4°C per circa 24 h così da far avvenire la separazione fra la fase acquosa e fenolica.

Eliminare la fase acquosa e sostituirla con

Tris-HCl 0.1 M pH 8 20 ml

Mescolare vigorosamente e lasciare a 4°C per circa 24 h.

Conservare a 4°C al riparo dalla luce.

Controllare di tanto in tanto che il colore del fenolo (giallo a causa dell'aggiunta dell'antiossidante idrossichinolina) non viri verso il rosa-arancio (il fenolo, in tal caso, si sarebbe ossidato).

Non utilizzare fenolo ossidato.

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MAXIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO

 

Nel nostro laboratorio l'estrazione del DNA plasmidico viene effettuata utilizzando il QIAGEN PLASMID KIT (Maxi, cat. 12162) che fornisce tutti i reagenti utilizzati, qualora non sia specificato diversamente.

1. Scongelare i pellet batterici ottenuti dopo centrifugazione della maxicoltura (vedi "Maxicoltura" ).

2. Dispensare 1 ml di Buffer P1 addizionato con RNasi A 100 mg/ml in ognuno dei 10 tubi contenenti i pellet, risospendere accuratamente e riunire la sospensione in un unico tubo di polipropilene con tappo a vite resistente ad alte velocità di centrifugazione.

3. Aggiungere 10 ml di Buffer di lisi P2 e mescolare delicatamente la sospensione mediante un movimento manuale "up and down".

4. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.

5. Aggiungere 10 ml di Buffer neutralizzante P3 e mescolare delicatamente la sospensione mediante un movimento manuale "up and down".

6. Incubare in ghiaccio per 20 min.

7. Centrifugare la sospensione a 12000 rpm a 4° C per 30 min.

8. Nel frattempo posizionare la colonnina cromatografica QIAGEN TIP 500 su un tubo Falcon mediante l'apposito adattatore fornito dal kit.

9. A tre minuti dalla fine della centrifugazione equilibrare la colonnina cromatografica caricandola con 10 ml di Buffer QBT ed aspettare che il buffer, per gravità, passi completamente attraverso la resina.

10. Recuperare il surnatante filtrandolo attraverso quadratini di garza sterile.

11. Caricare con il surnatante filtrato la colonnina precedentemente equilibrata.

12. Eliminare il surnatante non trattenuto dalla resina.

13. Lavare due volte la resina caricando la colonnina con 30 ml di Buffer QC.

14. Eluire la resina caricando la colonnina con 15 ml di Buffer QF e raccogliere l'eluato in un tubo Falcon da 50 ml.

15. Aggiungere all'eluato (15 ml) 0.7 volumi di alcool isopropilico (10.5 ml) e mescolare vigorosamente.

16. Suddividere la sospensione in due tubi Corex da 15 ml e centrifugare a 12000 rpm a 4° C per 30 min.

17. Eliminare il surnatante per versamento ed asciugare i pellet ponendo i tubi orizzontalmente nel liofilizzatore senza azionare la centrifuga.

18. Risospendere accuratamente ciascuno dei due pellet in 250 ml di TE.

19. Centrifugare per 2 min a 4° C a 3000 rpm così da poter recuperare ogni goccia di sospensione.

20. Trasferire i 500 ml di sospensione in una provetta eppendorf ed aggiungere 1 ml di etanolo assoluto freddo e 15 ml di NaAcetato 3M pH 5.2 .

21. Vortexare vigorosamente (il DNA estratto sarà visibile sotto forma di filamenti bianchi) e procedere con la precipitazione a -80° C per 30 min.

22. Centrifugare la sospensione a 11000 rpm per 10 min a 4°C.

23. Eliminare il surnatante e lavare il pellet aggiungendo 1.5 ml di etanolo 70% freddo .

24. Centrifugare a 11000 rpm per 10 min preferibilmente a 4°C.

25. Eliminare il surnatante facendo attenzione che il pellet non si stacchi dal fondo della provetta.

26. Asciugare il pellet ponendo la provetta nel liofilizzatore per pochi min.

27. Risospendere il pellet in 500 ml di TE e conservarlo a 4° C possibilmente per una settimana prima della quantificazione spettrofotometrica.

28. Conservare il pellet a -20°C.

 

1. Al momento della letturea spettrofotometrica,prelevare 5 ml di DNA plasmidico estratto ed aggiungere 595 ml di ddH2O (fattore di diluizione: 120)

2. Leggere a: 260 nm-280 nm-330 nm

in uno spettrofotometro a doppio raggio, utilizzando ddH2O come bianco.

3. Risalire alla concentrazione del campione applicando la seguente formula:

O.D. a 260 nm x 120 ( fatt. dil.) x 50 (coeff.estinzione molare per il DNA) 1000

così da avere la concentrazione del DNA espressa in mg/ml.

 

SOLUZIONI NECESSARIE PER LA MAXIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO

Le seguenti soluzioni sono fornite dal kit:

Buffer P1

RNasi A

Buffer di lisi P2

Buffer neutralizzante P3

Buffer QBT

Buffer QF

Buffer QC.

 

Na Acetato 3M pH 5.2 (100 ml)

Sciogliere in 60 ml di ddH2O

NaAcetato 24.42 g

Aggiustare il pH con Acido Acetico glaciale (la polvere si scioglie a pH acidi)

Portare a volume.

 

TE pH 8

Ricetta già descritta nella metodica "Miniprep di DNA plasmidico".

indice

REAZIONE DI LIGAZIONE

 

1. Digerire:

1 mg di DNA plasmidico vettore

10 mg circa di DNA plasmidico contenente il frammento di cDNA da inserire con 1 o 2 enzimi di restrizione opportunamente scelti, (vedi "Digestione enzimatica" ).

2. Separare i prodotti di digestione enzimatica mediante elettroforesi su gel d' agarosio in TAE e recuperare il tassello di gel contenente le bande d'interesse (vedi "Digestione enzimatica" ).

3. Purificare il DNA dal gel mediante Gene Clean (vedi" Gene Clean" ) recuperando l'eluato in un volume finale di 20 ml.

4. Preparare una scala standard dei markers di peso molecolare noto ( vedi " Quantizzazione di probe" ).

5. Effettuare sullo stesso gel d' agarosio in TBE una corsa elettroforetica di 2 ml (1/10 dell'eluato) di ciascun campione di DNA estratto e della scala standard dei markers.

6. Valutare empiricamente la quantità dei DNA estratti comparando l' intensità luminosa delle bande ottenute con quella dei frammenti dei markers di peso molecolare corrispondente ( vedi " Quantizzazione di probe" ).

7. Allestire la reazione di ligazione in un tubo da PCR:

DNA plasmidico x ml

Inserto y ml*

T4 DNA ligasi buffer (10x) 2 ml (1x)

T4 DNA ligasi ( 1U/ml) 1 ml

ddH2O fino a raggiungere un volume di 20 ml

* Il rapporto molare del plasmide e dell' inserto deve essere 1:1.

8. Incubare la reazione a 15°C per 16-18 h nel DNA Thermal Cycler ( File 70).

9. Utilizzare 10 ml o 20 ml del prodotto di ligazione per trasformare 100 ml di batteri competenti (vedi " Trasformazione" ) prolungando il tempo di incubazione in bagno a 37°C per 4-6 h.

10. Preriscaldare due piastre di LB solidificato con Agar contenente ampicillina 100 mg/ml a 37°C.

11. Dispensare su ciascuna piastra 50 ml di x-gal 2% e distribuirli mediante una pipetta Pasteur piegata a formare un triangolo ( spreader) sterilizzata in etanolo al 70% e lasciata asciugare per pochi secondi all' aria sotto cappa sterile.

12. Lasciare asciugare le piastre per circa 1/2 h.

13. Dispensare su ciascuna piastra rispettivamente 150 ml e 250 ml di sospensione di batteri trasformati e distribuirli mediante uno spreader.

14. Incubare le piastre in termostato a 37°C, capovolgerle dopo circa 1/2 h e lasciarle per 16-18 h.

15. Valutare la presenza di colonie bianche ricombinanti e blu non ricombinanti. Nel caso in cui la distinzione dei colori non sia chiara, tenere le piastre a 4°C per un giorno. Considerare ricombinanti le colonie che rimangono bianche con un puntino blu al centro.

16. Prelevare mediante aghi sterili 8 colonie bianche ed una blu ed inoculare ciascuna in 10 ml di LB Medium contenente ampicillina 100 mg/ml.

17. Incubare le colture in bagno termostatato a 37°C in agitazione per 16-18 h.

18. Conservare le colture a 4°C fino al momento dell' estrazione del DNA.

19. Effettuare una minipreparazione di DNA plasmidico (vedi " Miniprep di DNA plasmidico' ) e controllare la qualità del DNA estratto mediante digestione enzimatica con gli enzimi di restizione utilizzati per il subclonaggio (vedi " Digestione enzimatica" ).

 

SOLUZIONI NECESSARIE PER LA LIGAZIONE

x-gal 2%

Se il reagente é in soluzione, controllare la concentrazione ed eventualmente diluire con N-N Dimetilformammide fino alla concentrazione richiesta (2%).

Se il reagente é in polvere, ricostituirlo con N-N Dimetilformammide potandolo alla concentrazione richiesta (2%).

Conservare a 4°C al riparo dalla luce.

indice

DIGESTIONE ENZIMATICA

 

Per verificare la qualità del DNA plasmidico estratto con la minipreparazione o con la maxipreparazione, allestire le seguenti reazioni enzimatiche:

DNA plasmidico 5 ml ( DNA da miniprep)

Buffer per Enz. Restr. (10x) 2 ml (1x)*

Enz. Restr. 1-5 U (una punta di enzima)

RNasi A 100 ng/ml 4 ml c.f. 20 ng/ml

dH2O fino a raggiungere un vol. di reaz. di 20 ml

oppure:

DNA plasmidico 1 mg ( DNA da maxiprep)

Buffer per Enz. Restr. (10x) 2 ml (1x)*

Enz. Restr. 1-5 U (una punta di enzima)

dH2O fino a raggiungere un vol. di reaz. di 20 ml

Incubare la reazione in bagno termostatato alla temperatura ottimale a cui l'enzima lavora (di solito 37°C) per 2h.

Stoppare la reazione in ghiaccio.

*Controllare sul foglietto illustrativo allegato all' enzima che il buffer corrispondente vada usato alla conc. 1x. In caso contrario, aggiustare la conc. come richiesto.

Qualora sia necessario digerire lo stesso DNA plasmidico con due enzimi di restizione che lavorano alla stessa temperatura, assicurarsi che i buffers dei due enzimi siano compatibili in riferimento alla loro concentrazione salina (consultare le tavole del " Protocols and Application Guide-Promega", pag 23-24). In particolare, evitare di effettuare una doppia digetione con due enzimi che funzionano a concentrazioni saline molto diverse fra loro.

 

DOPPIA DIGESTIONE CON ENZIMI I CUI BUFFER SONO COMPATIBILI

DNA plasmidico 5 ml (da miniprep) opp 1 mg (da maxiprep)

Buffer per Enz. Restr I (10x) 1 ml (0.5x)**

Buffer per Enz. Restr II (10x) 1 ml (0.5x)**

Enz. Restr. I 1-5 U (una punta di enzima)

Enz. Restr. II 1-5 U (una punta di enzima)

RNasiA 100 ng/ml 4 ml c.f. 20 ng/ml (per DNA da miniprep)

ddH2O fino a raggiungere un vol. di reaz. di 20 ml

Incubare la reazione in bagno termostatato alla temperatura ottimale a cui gli enzimi lavorano (di solito 37°C).

Stoppare la reazione in ghiaccio.

**Controllare sul foglietto illustrativo allegato all' enzima che il buffer corrispondente vada usato, nella singola digestione, alla conc. 1x e dimezzarne la concentazione. In caso contrario, utilizzare comunque per ogni buffer la metà della conc. richiesta.

 

DOPPIA DIGESTIONE CON ENZIMI I CUI BUFFER SONO INCOMPATIBILI

DNA plasmidico 5 ml (da miniprep) opp 1 mg (da maxiprep)

Buffer per Enz. Restr. I (10x) 2 ml (1x)***

Enz. Restr. I° 1-5 U (una punta di enzima)

RNasiA 100 ng/ml 4 ml c.f. 20 ng/ml (per DNA da miniprep)

dH2O fino a raggiungere un vol. di reaz. di 20 ml

Incubare la reazione in bagno termostatato alla temperatura ottimale a cui l'enzima lavora (di solito 37°C).

Stoppare la reazione in ghiaccio.

° Enzima con buffer a conc. salina più bassa

Nello stesso tubo di reazione aggiungere:

Buffer per Enz. Restr. II (10x) 3 ml (1x)***

Enz. Restr. II°° 1-5 U (una punta di enzima)

dH2O fino a raggiungere un vol. di reaz. di 30 ml

Incubare la reazione in bagno termostatato alla temperatura ottimale a cui gli enzimi lavorano (di solito 37°C).

Stoppare la reazione in ghiaccio.

°° Enzima con buffer a conc. salina più alta

***Controllare sul foglietto illustrativo allegato all'enzima che il buffer corrispondente vada usato, nella singola digestione, alla conc. 1x. In caso contrario, aggiustare la conc. come richiesto.

Controllare il prodotto di digestione enzimatica mediante corsa elettroforetica su gel d'agarosio in TBE 1x, con percentuale che dipende dalle dimensioni dei frammenti da separare .

Nel caso in cui si voglia effettuare un taglio enzimatico per poi estrarre un frammento di DNA mediante Gene Clean, , digerire una quantità di DNA pari a 8-10 mg, in un volume finale di 50 ml, utilizzando 1-5 U di enzima/mg di DNA plasmidico.

Caricare l'intero prodotto di digestione su un gel d'agarosio in TAE 1x ad opportuna concentrazione cercando di utilizzare il minor numero di pozzetti possibili.

Separare i frammenti di DNA mediante corsa elettroforetica in tampone TAE.

Una volta completata la separazione, tagliare il tassello di gel contenente la banda d'interesse, posizionarla in un tubo eppendorf e conservarla a 4°C fino al momento del Gene Clean.

P.S. Gli enzimi di restizione sono conservati in un buffer contenente glicerolo al 50%. Quando la concentrazione di glicerolo nel volume di reazione supera il 10%, esso può causare "star activity" degli enzimi di restrizione. Pertanto è buona norma evitare, durante l' allestimento della reazione, di superare questa concentazione. Se si dovesse essere obbligati ad utilizzare un alto volume di enzima, è consigliabile aumentare il volume di reazione.

 

SOLUZIONI NECESSARIE PER LA DIGESTIONE ENZIMATICA

Buffer per Enz. Restr. (10x)

I buffer per gli enzimi di restrizione sono forniti insieme all'enzima.

RNasiA 100 ng/ml (10 ml)

Sciogliere in 10 ml di ddH2O.

RNasi A 100 mg c.f. 10 mg/ml

Bollire per 2 min.

Lasciare raffreddare ed aliquotare in volumi pari a 500 ml.

A seconda del bisogno, diluire 1:10 in ddH2O lo stock preparato , così da avere una soluzione a concentrazione finale 100 ng/ml.

Conservare a -20°C.

TBE 10X (500 ml)

Sciogliere in 400 ml di ddH2O:

Tris base 54 g

Acido borico 27.5 g

Sodio EDTA 4.65 g

Aggiustare il pH a 8.3 con acido borico o tris base in polvere.

Portare a volume con ddH2O.

Autoclavare e conservare a temp.amb.

TAE 50x (500 ml)

Sciogliere in 400 ml di ddH2O

Tris Base 121g

Acido acetico glaciale 28.55 ml

EDTA 0.5 M pH 8 50 ml

Portare a volume con ddH2O.

Autoclavare e conservare a temp.amb.

indice

COMPETENZA DI CELLULE BATTERICHE

 

Tutte le operazioni finalizzate alla messa in coltura dei batteri vanno condotte sotto cappa sterile utilizzando materiale, terreni e soluzioni sterili.

I batteri utilizzati nel nostro laboratorio appartengono al ceppo JM105 della specie E. Coli, AmpS.

1. Prelevare da uno stock in glicerolo al 20% un'aliquota di batteri JM105 mediante un' ansa di plastica sterile.

2. Seminare i batteri su una piastra di LB Medium solidificato con agar, preriscaldata a 37°C, mediante un movimento a zig-zag.

3. Porre la piastra capovolta in termostato a 37°C e lasciare crescere i batteri per tutta la notte.

4. Prelevare una colonia singola mediante un ago sterile ed inocularla in 15 ml di LB Medium.

5. Porre la coltura in bagno termostatato a 37°C in agitazione per 16-18 ore.

6. Inoculare 1 ml di sospensione batterica in 50 ml di LB Medium fresco e tenere la coltura in bagno termostatato a 37°C in agitazione per 2 ore circa.

7. Controllare la crescita batterica mediante lettura spettrofotometrica a 600 nm, riempiendo una cuvetta monouso con 3 ml di sospensione batterica prelevata sterilmente ed utilizzando come bianco LB Medium.

8. Una volta raggiunta l' assorbanza di 0.2-0.3 O.D., stoppare la crescita batterica ponendo la beuta in ghiaccio per 10 min.

9. Trasferire la sospensione batterica in un tubo Falcon e centrifugare a 4000 rpm, a 4°C per 15 min.

10. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 25 ml di CaCl2 0.1 M freddo e porre la sospensione in ghiaccio per 30 min.

11. Centrifugare a 4000 rpm a 4°C per 15 min, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 2.5 ml di CaCl2 0.1 M freddo.

12. Tenere la sospensione in ghiaccio per 1h e conservarla a 4°C per 24 h al fine di aumentare l'efficienza del processo di competenza.

13. Aggiungere alla sospensione batterica un ugual volume di glicerolo sterile al 40% ( conc. fin. 20%), mescolare manualmente e conservare a -80°C.

 

MATERIALI E SOLUZIONI NECESSARIE PER LA COMPETENZA

LB Medium (500 ml)

Sciogliere in 400 ml di ddH20:

NaCl 5 g

Bactotriptone Difco 5 g

Yeast Extract 2.5 g

Portare a volume con ddH20.

Autoclavare per 2 volte (facendo raffreddare il terreno fra un ciclo e l' altro).

Conservare a temperatura ambiente.

Piastre di LB Medium solidificato con Agar all' 1.5% (200 ml)

Sciogliere in 150 ml di ddH20:

NaCl 2 g

Bactotriptone Difco 2 g

Yeast Extract 1 g

Portare a volume con ddH20.

Trasferire in una bottiglia il brodo di coltura ed aggiungere:

Agar Noble Difco 3 g

Autoclavare per 2 volte (facendo raffreddare il terreno fra un ciclo e l' altro).

Lasciare raffreddare il terreno fino a 50°C circa in modo tale che non si solidifichi.

Versare circa 10 ml di terreno in piastre Petri sterili posizionate in piano sotto cappa sterile.

Lasciare solidificare le piastre sotto cappa e fino a quando la condensa sui coperchi non si asciuga.

Sigillare le piastre con Parafilm e conservarle in camera fredda (4°C).

CaCl2 0.1 M (100 ml)

Sciogli